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胴
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イネラギッドスタントウイルスゲノムの分子構造解析
北海道大学大学院農学研究科
農業生物学専攻　博士課程
　　　　須賀　晴久
　　　　平成7年度
　　　　　”’N一一一一．
謝辞
　本研究の遂行及び、本論文の執筆にあたり、御指導いただいた
北海道大学農学部植物ウイルス病学・菌学講座の木村郁夫元教授、
上田一一郎教授、畑谷達治助手、四方英四郎名誉教授、大島一里元助手、
佐野輝男元助手、諸先輩方に厚くお礼申し上げる。また、本講座、並
びに他講座の皆様に有益な御指導を賜ったことを深く感謝申し上げる。
目　　次
1・緒言……・…………・・………………◆・・…・・　001
：E，研究史・■■・■一・一一・・…　一・・・・・…　一■・・…　一・・・…　■一・・…　003
　1．植物レオウイルスの分類……………　…・…　“一・・…一■003
　2．イネラギッドスタント病とその病原ウイルス…・…・……003
　3．イネラギッドスタントウイルス（RRSV｝の分子生物学的研究・006
　4．Oryza　vi　rus属のウイルス………・……・…・………O14
皿・材料と方法■■・…　…・……・・・…　…◆・…■■・…■■■■．．．O16
　1．ウイルス源と媒介昆虫……・…………・・…………016
2．RRSV粒子の純化…………・…・…・………・・……O16
　3．　Enzyme－linked　immunosorbent　assay　（ELISA）　・・・・・・…　　018
4・罹病イネからのRRSVゲノムの抽出……………・…・・■■O19
5．トビイロウンカからのRRSVゲノムの簡易的抽出・…・……・021
6・RRSVゲノムのSDS－PAGE・…・……・…・◆……・…・…・021
　7，　PAGE　（SSCP）　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…　　　022
8．銀染色（核酸）・・…………・・………………・…　022
9・コロニーーハイブリダイゼー・・一・・一dLション………………・・…　023
　　①塩化カルシウムによる大腸菌の形質転換・…・・…・・…・023
　　②プラスミドのナイロンメンブレンへの吸着・…・………024
　　③プローブの作成………………・・■■…………・・024
　　④ハイブリダイゼーション・………・■一・一■…・……・．＿026
10．ドットプロ：ットハイブリダイゼt・一・・一・一ション……・…・……027
　　①セグメントのナイロンメンブレンへの吸着・…“■…＿，027
　　②プローブの作成（ランダムラベリング法）………＿．028
　　③ハイブリダイゼーション………………・…＿＿029
11・サザンプロットハイブリダイゼーション…………・…・029
　　①ゲルからナイロンメンブレンへ核酸の転写………・＿029
　　②プローーブの作成・・…・……・……………・…・．．030
　　③ハイブリダイゼーション・…………・・…………・030
12・DMSO変性………・・………・…・・……………・031
13・逆転写反応（M一肌V逆転写酵素）……・……・……・◆・031
14・　Polymerase　chain　reaction　（PCR）・・・・・・・・・・・・・・・・…　　031
15・サブクローニングとDNAの平滑末端化…………・…＿032
　①プラスミドに挿入するDNA断片の調整…・……………　032
　②プラスミドベクターの調整・……………・………・034
　　簸冒“　・蓋　　　　鎌
　　　　　　灘　　　　　櫛・　　欄葦，ρ．艦鍵
　　　　　，叢搬
，灘難蟻驚　　　｝野
　　③ライゲーション・・…・…・………・■■・…・………　034
　　④大腸菌の形質転換・・…・……・…・………・・…・…035
　16，大腸菌からのプラスミド抽出（アルカリ法）・…………036
　17．アガロースゲル電気泳動…………・…・…・…・…　　037
　18・シークエンサ・一・一・・‘を利用した塩基配列の決定…………・・037
　　①反応…………・……・■■……■■・………・…・．037
　　②電気泳動■■・………・…・……・・…………・・…039
　19．32Pを使用した塩基配列の決定…………・…・…・・…・039
　20・大腸菌によるタンパク質の発現とタンパク質のSDS－PAGE、
　　　ウェスタンプロッティング…　■“…・・…　…・…・一…・・040
　　①大腸菌によるタンパク質の発現…・……………・…　040
　　②タンパク質のSDS－PAGE…・…・…・……………＿041
　　③クマシー染色……………・…………・……．．042
　　④銀染色・・……・…・…・…………・……・・…＿042
　　⑤ウェスタンプロッティング・…・………・…・・……・043
　21．アミロ：一一スレジンカラムによるMBP融合タンパク質の分離…045
　22・大腸菌タンパク質からGST－PIOminiの分離……………046
　23・タンパク質の濃度測定（Bradford法）………・…・…・047
　24．GST融合タンパク質でマウスを免疫する方法……・……・047
　25．抗体の精製………・……・・………………・・…　049
　26・SP6ポリメラーゼによる転写反応・……………・……　049
　27．コムギ胚芽抽出液による翻訳反応…………・・……・・050
1V．結果と論議………………・・…………・……・…051
　1．Sl－S8がコードするタンパク質の解析…………・…・051
　　結果■■・・……■“…・・…・・……　………・……　…・051
　　①cDNAとセグメントの対応……………・…・……’●051
　　②S1－S8がコードするタンパク質の部分的発現…………062
　　③発現タンパク質とRRSV純化粒子に対するポリクロ・・一・一・・ナル抗
　　　体（抗RRSV粒子抗体）の反応…・・………・…・・…・072
　　④RRSV構造タンパク質と発現タンパク質に対するポリクロー
　　　ナル抗体の反応・…　■■■t・・・・・・・・・・・…　……　■■…　“・・073
　　ヨムせ　　ロ冊両舷．．、．．・．．・・・・・・・・・・・・・・・・…　　。・・・・・・・・・・・・・・・・・…　　　077
2・S9の解析………・……・…・………………・・…　088
　　結果・・………・・……・・…　………・・…・…　…．。．088
　　①PAGEによるS9の変異の検出…………・……・……088
　　②SgLとSgUの塩基配列の比較・・……………・・’…・’●089
　　③843番目の塩基置換によるS9のPAGE上の移動度の変化・・…092
　　④SgUとSgLの簡易検定法の確立………・………・・…096
　　⑤トビイロウンカ各個体が保毒したRRSVのS9の検定・・……097
　　⑥SgUとSgLの両方が検出される罹病イネから伝搬したRRSV・・102
　　⑦S9がコードするタンパク質（P9）の大腸菌による発現…・104
　　⑧P9と抗RRSV粒子抗体の反応……………・……　…・109
　　⑨RRSVの構造タンパク質とMBP－P9に対するポリクローナル
　　　抗体（抗MBP－P9抗体）の反応・……・・・・・・・・・・・・・・…　109
　　⑩SgL　RRSVの伝搬効率…………・……・・…・……llO
　　ヨム　　両冊面我。…　　。・。・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…　　。・・・・・・・・…　　113
　3．SlOの解析………・…・……・………………・…　120
　　結果…・…・……・一…・・・・…　……・…・…・・一…123
　　①S10の主要なORFがコードするタンパク質（P10）の大腸菌
　　　による発現………・…・……・……　■■……・…・123
　　②S10の小さいORFがコードするタンパク質（P10mini）の大
　　　腸菌による発現■■■■………・・…・・…　……　……・127
　　③P10とPlOminiの検出…………・……・…・……・・132
　　④コムギ胚芽抽出液によるSlOのmRNAの翻訳…・…・……138
　　ヨム　　fime・iilSt’’’’’’’”◆’●●”○”○’’”。…　　。・・・・・・・・・・・・・・・・・…　　　142
V．総合論議……・………・・…・………………　…．147
VL摘要・…　……　…・・…　■■・・………・・・…　…・・・・・…　150
W．引用文献…・■■…・…■■・…・………　…・…・・・…　…154
　付録（略語と試薬）…■■・…・…　……　…・◆“■・・・…　■■■■164
　　　　　　　　　　　　　（RRSVに関する略語は付録を参照のこと）
　　　　　　．蕪欝
。。＃灘ww＿　灘灘　灘鳳 雛　幽幽　　贈辮
望籔、鑛
1．緒言
　レオウイルス科のrice　ragged　stunt　Oryzavirus（RRSV）によっ
て起こされるイネラギッドスタント病は、東南アジア各地で発生して
いる重要病害である。RRSVのゲノムは10本に分節した2本鎖RNA
（dsRNA）で、電気泳動で移動度の遅いものからセグメント（S1）か
らSlOと呼ばれている。ゲノムに対するcDNAがクロー・ニングされ、　S9
とSlOの全塩基配列が決定された（Lee　eta1．，1987；Yan　eta1．，
1995：Uyeda　etal．，1995b）。S9では通常のS9（SgU）に混ざっ
て電気泳動の移動度が早いもの（SgL）が検出されたが（Yan，
1992）、移動度の異なる原因が分からなかった。決定されたS9の塩基
配列はSgUのもので、片方の鎖に一つの読み取り枠（ORF）が見出され
た。一方、S10では主要なORFとその上流に小さいORFが見出された。
このようにRRSVではゲノムの解析が徐々に進んでいるが、遺伝子産物
に関する情報は少ない。これまでの解析から、RRSVの遺伝子産物と唯
一考えられるのは、粒子を構成するタンパク質（構造タンパク質）で
ある。RRSVでは純化粒子の解析から量比において主要なタンパク質5
種類と主要ではないもの2種類が報告されている（Hagiwara　eta1．，
1986；　Chen　et　aL，　1989b）　．
　比較的ゲノムが小さいウイルスでは既に全塩基配列が決定され、感
　　　　　　　　　　　　　　　1
ぞ
蕩
贈
染における遺伝子の機能が解明されつつある。構造遺伝子の場合、そ
の塩基配列から得られるアミノ酸配列と既に機能が分かっているタン
パク質のアミノ酸配列を比較することで遺伝子産物の機能が推定でき
る可能性がある。また、ウイルス感染で特異的に検出されるタンパク
質では、発現時期や発現部位などの情報が機能の推：定に役立つ。RRSV
のように遺伝子操作系が確立していないウイルスでは、病臥や伝搬性
など性状を異にする自然変異体のゲノムやタンパク質の比較から遺伝
子産物の機能が推定できることがある。これらの研究ではウイルス遺
伝子から発現しているタンパク質を同定しなければアミノ酸配列とタ
ンパク質、両方の情報から遺伝子産物の機能を推定することができな
い。従って、感染の分子機構の解明するために遺伝子産物を同定する
ことが重要である。
　RRSVのS1－S8の塩基配列は決定されていないが、これまでのレオウ
イルス科ウイルスのゲノムの解析からそれぞれのセグメントに一つの
長いORFがあると考えられる。本研究ではRRSVの各遺伝子の発現産物
を同定することを目的とし、各セグメント上のORFと構造タンパク質
の対応を調べた。また、S9ではSgLの塩基配列を決定して移動度が早
くなった原因を明らかにした。SlOに関しては真核生物の通常のmRNA
と異なるORFの構造を持つことから、特殊な翻訳機構があると考えら
れたので主要なORFと小さいORF、両方の翻訳産物の検出を試みた。
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II．研究史
1．植物レオウイルスの分類
　植物レオウイルスは分類学上、レオウイルス科に属し、ウンカまた
はヨコバイにより永続的に媒介され、10本あるいは12本に分節した2
本鎖RNA（dsRNA）のゲノムを持つ。植物レオウイルスはウイルス粒子
の形態、セグメントの数、媒介昆虫の種類などにより、
Phytor　eo　vi　ru　s属、　Fi／ivirus属、　Oryza　virus属に分類されている。
イネラギッドスタントウイルスはOryza　virus属に分類されている。
2，イネラギッドスタント病とその病原ウイルス
　イネがイネラギッドスタントウイルス（rice　ragged　stunt
Oryza　virus：RRSV）に感染すると萎縮、葉が短くなる、葉先が捻転
する、葉縁が切れ込む、葉脈に沿ってswellingが生じる、茎が分枝す
る、穂が異常となる、空籾が生ずるなどの症状を示す。この病気は、
1977年までに知られていたイネのウイルス病とは異なる病徴を示すこ
とからインドネシアとフィリピンで新しいウイルス病として報告され
（Hibino　eta1．，1977；Ling　e亡a1．，1978）、その後、インド、
　　　　　　　　　　　　　　　3
灘
．顯
　．　kt　　　　　　’。灘懇
中国、日本、マレーシア、スリランカ、台湾、タイなど東南アジア各
地でも発生が報告された（Milne　e亡ai．，1982）．宿主範囲はイネ
科に限られ、イネ（Oryza　sa・ti・va）の他、人工接種ではトウモロコシ、
オオムギ・ライムギ、コムギにも感染する（Hibino，1979；河野，
1984）．但し、トウモロコシ、オオムギに関しては感染しなかった報
告もある（Senboku　e亡a1．，1978；Shikata　eta1．，1979）。品
種に関して中野ら（1981）は実験に用いたすべてのイネ（日本イネ28
品種、外国品種5品種）が感受性であったと報告している（大畑，稲
の病害　参照）。
　電子顕微鏡観察の結果、RRSV罹病イネに50－60nmのレオウイルス様
の球状粒子が確認された（Hibino　e亡a1．，1977：Ling　etal．，
1978：Shikata　etal．，1979；Hibino，1979）。純化方法が確立
するに従って、RRSV粒子は2重殻構造を持つFゴノMrαs属のsubviral
particleに一致する構造であるらしいことが分かった。しかし、外殻
が壊れているのか（Hibino，1979）、本来存在しないのかは明確で
はない（Milne・1980）。Fi／i　virus属のsubviral　particleには円
筒状のBスパイクがある。RRSV粒子にも同様に正20面体の各頂点にス
パイクがあるが、円筒状ではなく、先端に対し基部が広がっている
（Milne・1980｝。更に、　MarkhamらのRotation法によってそれら
は5角形であることが示された（Kawano　eta1．，1984）。免疫電子
顕微鏡法・寒天ゲル拡散法でFi／ivirus属のrice　black－streaked
4
virus　（RBSDV）　．　maize　rough　dwarf　virus　（MRDV）　．　oat
sterile　dwarf　virus（OSDV）とRRSVは血清学的に関係ないことが
示されている（仙北ら，1979；Milne　e亡aL，1979；Hibino，
1979）．NaあるいはK　phosphotungustate（pH7．5）処理はMRDVの
Bスパイク、reovirus、1eaf　hoPPer　A　virus、　cytoplasmic
polyhedrosis　virus（CPV）の粒子構造には影響しないが（Milne
et　a1．，1982）、Fi／ivirus属のウイルスではBスパイクが消失するも
のがある・また、100ng／μ1α一キモトリプシン処理は同様の効果が
ある（Milne，1980；Milne　eta1．，1982）。RRSVでは、キモトリ
プシンによって、スパイクの分解が電子顕微鏡で観察された（Milne
，1980）。また、0．5M　MgC12処理でもスパイクは分解される。但し、
0．1M処理では効果はない（Hagiwara　eta1，，1986；Yan，
1992）　o
　RRSVはトビイロウンカ（Nilaparyata　Iugens）によって永続的に
媒介され・他のウンカ、ヨコバイによる伝搬や機械的伝搬は認められ
ていない（Hibino　eta1．，1977：Ling　etal．，1978；仙北ら，
1978；Hibino，1979；Shikata　eta1．，1979）。RRSV保毒媒介昆
虫体内の唾腺神経組織、筋肉、脂肪体、前例の細胞質にバイロプラ
ズム様の封入体が確認され、特に、脂肪体の細胞には多くのウイルス
様粒子が認められた（Hibino，1979；Hibino　eta1．，1979）。
RDVが植物宿主だけでなく媒介昆虫体内でも増殖することが示されて
5
・三二　　顯
　灘鍵灘i、　nt
以来（Fukushi　eta1．，1940）、それが植物レオウイルスに属する
ウイルスの特徴とされている。伝搬試験と電子顕微鏡観察の結果はト
ビイロ：ウンカ体内でRRSVが増殖していることを示している
（Shikata・1981；Milne　e亡al・，1982）。また、　RDVはその媒介
昆虫であるツマグロ：ヨコバイ　（Neph　o　tetix　cincticeps＞、イナズマ
ヨコバイ（Recilia　dorsalis）で経卵伝染するが（Shikata　et　a1．，
1981）、RRSVはトビイロウンカで経卵伝染はしない（Ling　eta1．，
1978）。トビイロウンカはRRSVを獲得するのに最低3時間の吸汁が必
要で潜伏期間は平均で9日（2－33日間）、接種は最低1時間の吸汁が
必要である。接種後は10－36日で病徴が現れる。約40％（6－76％）の
トビイロウンカがウイルスを媒介する。媒介率は雌雄では変わらない
が、成虫より若令の方が高い。潜伏期間を経たトビイロ：ウンカは持続
的でないときもあるが、一生媒介能を持つ（Hibino，1979；Milne
et　al，，　1982）　．
3・イネラギッドスタントウイルス（RRSV）の分子生物学的研究
　RRSV粒子にELISA（enzyme－linked　i皿munosorbent　assay）法、
ISEM（immunosorbent　electron　microscopy）法が適用され、検
出が容易になった（Luisoni　e亡a1．，1982）。また、　Hibino　and
Kimura（1982）はRRSV保毒媒介昆虫からELISA法でウイルスの検出
　　　　　　　　　　　　　　　6
を試み、磨砕液にpH7，0の緩衝液を使用すると卵を保持している雌の
非特異的反応が起きてしまうが、pH6．0の緩衝液では抑えられること
を示した。トビイロウンカにRRSVを注射して保毒させられることから、
純化の際、感染性粒子の確認にこの方法が用いられた（仙北ら，
1978；Hibino，　1979；Shikata　etal．，　1979；仙北ら，　1979；
Kawano　et　al，，　1983；　Omura　et　al．，　1983）　．　Rice　grassy
stunt　Tenuivirus（RGSV）の媒介昆虫はRRSVと同じトビイロ：ウンカ
で、永続的に伝搬される。RRSVとRGSVでは交叉免疫現象が起こらず、
混合感染して両方の病徴が現れる（Hibino　e亡a1．，1977；Ling　et
a1．，1978）。Noda　eta1，（1991b）はコロニーによってはトビイロ
ウンカにNiiaparvata　lugens　reovirus（NLRV）が潜在感染してい
ると報告し、そのウイルスは直径65nmの2重殻で、10本に分節した
dsRNAのゲノムを持ち、垂直伝搬していることを示した。　NLRVはイネ
を介して水平伝搬もするが、その際、イネでの増殖は認められていな
い（Noda　and　Nakashima，1995）。媒介昆虫の組織培養も試みら
れており、Chiu　and　Black（1967）はpotato　yellow　dwarf
Rhab・do・virusとWTVの媒介昆虫であるAgallia　constrictaの細胞株の
確立に初めて成功し、その培養細胞でWTVが増殖することを証明した。
また、RDVの媒介昆虫であるヨコバイ（Neph　o　tettix　cincticept）、
クロスジツマグロヨコバイ（N，nigropictus）、イナズマヨコバイ
　（Rec・il・ia　dorsalis）の細胞株も確立され、　RDVを感染させることに
　　　　　　　　　　　　　　　　7
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成功した（木村，1987）。しかし、トビイロ：ウンカ（Nilaparvata
lugens）では継代培養が成功していない（仙北と四方，1980）。
　RRSVの純化法については緩衝液として0．5Mリン酸、5mM
ethylene－diaminetetraacetic　acid　（EDTA）　（pH6．0）
（Shikata　e亡al，，1979）、0，4Mリン酸カリウム、0・02M硫酸ナ
トリウム、0．OIM　diethylditiocarbamate（pH7．6）　（Milne　e亡
a1．，1982）、0．2Mグリシン、5mM　EDTA、0．5M　sodium
ascorbate（Hibino　and　Kimura，1982）、Histidine緩衝液
（Omura　e亡a1．，1983）を使用したものが報告されており、有機溶
媒処理には四塩化炭素やプレオン（Shikata　eta1．，1979：Milne
e亡a1．，1979；Hibino　and　Kimura，1982）が、また、界面活性剤
としてトリトンX－100（Omura　e亡a1．，1983）、Nonidet　P－40
（Milne　etal．，1982）が用いられた。純化の際、ショ糖密度勾配
遠心分離後、2つのバンドが現れることがあるが、その場合は下側のバ
ンドにのみに感染性が認められる（Hibino　and　Kimura，1982；
Milne　e亡a1．，1982；Kawano　eta1．，1983）。また、0．IM酢酸
アンモニウムで磨砕した場合、罹病イネ汁液は4℃で7日以上、105倍
希釈まで、保毒虫磨砕液は106倍希釈まで活性が認められ、罹病イネ汁
液では60℃、10分間で失活し、凍結融解を3度繰り返しても活性は低
下せず、pH6－9の範囲で安定であることが報告されている（仙北ら，
1979；　Hibino，　1979）　．
　　　　　　　　　　　　　　　8
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測
灘
…
錘
　　　一”一レ
　Boccardo　and　Milne（1980）は、　RRSV感染葉から抽出したRNAが
DNaseに対して抵抗性であること、2M　Lic1処理で沈澱しないこと、
0．15M塩化ナトリウム、0．015Mクエン酸ナトリウム（pH7．0）緩衝
液中で83℃で濃色効果が認められることを示し、その核酸がdsRNAで
あるとした。また、5％Polyacryla皿ide　gel　electrophoresis
（PAGE）にて総分子量11，63×106Daになる8本のセグメントを確認し、
10本のセグメントからなるFi／i・virusとは分節数が異なり、MRDVとは
移動度も異なることからRRSVは違うグル・…一’・プであることを示唆した。
その後、Omura　eta1．（1983）は純化ウイルスから得られたdsRNAを
7，5％PAGEで9本に分離し、　densitometric　tracingの結果からセ
グメント数が10本で総分子量は22，91×IO6Daであると報告した。
Kawano　e亡al．（1984）はRRSVのゲノムが7．5％PAGEで10本、5％、
10％、15％では9本に分離し、総分子量16，5×106Daであると報告し、
粒子構造の違い、核酸の総分子量の違いからRRSVがPhytoreovirus属
とFi／ivirus属のどちらにも属さないことを示唆した。　Uyeda　e亡a1．
（1990b）は、　tobacco　mosaic　Tob・am・ovir・us（TMV）のdsRNAと
RDVのセグメント10（S10）、RRSVのS9を基準とし、電子顕微鏡観察
によって各セグメントの分子量が0．78×106－2，58×106Daで、塩基
配列数が1157－3849塩基対であると推定した。
　動物レオウイルスにおいて、ウイルス粒子にRNA依存RNAポリメラPt
ゼが存在することが示されて以来　（Shatkin　and　Sipe，1968）、
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植物レオウイルスでもPhytor　eo　vi　ru　s属のWTV（Black　and　Night，
1970；　Reddy　et　aL，　1977；　Nuss　and　Perterson，　1981）　．
RDV　（Kodama　and　Suzuki，　1973；　Uyeda　and　Shikata，
1984）　．　rice　gall　dwarf　virus　（RGDV）　（Yokoyama　et　al．，
1984）、Fi／ivirus属のFiji　disease　virus（FDV）　（Ikegami
and　Francki，　1976）　．　RBSDV　（Uyeda　et　aL，　1987）　．　MRDV
（Marzachi　etal．，1990）においてその存在が報告された。　RRSV
においても粒子にポリメラーゼ活性があり、10本の全セグメントが転
写されることがハイブリダイゼ・・一・一”ションによって確認された。更に、
キモトリプシンによって、また、S－adenocy1－L－methionine
（SAM）によってこのポリメラーゼ活性が促進されることが示され、
RRSVの転写系にCPVで確認されているようなSAMによる転写調節部位
が存在することが示唆された（Uyeda　e亡al。，1987；Lee　eta1．，
1988）　e
　Miura　e亡al．（1974）によってCPVの核酸の5’末端がブロックされ
ていることが発見された。その構造はm7G（5’）PPP（5’）GmpCであるこ
とが分かり（Furuichi　and　Miura，1975）、初めてのキャップ構
造の報告となった。植物レオウイルスではWTVのmRNAの5t末端に
キャップ構造、皿7G（5’｝ppp（5‘）Ampが存在すると報告されているが
（Rhodes　et　al．，1977）、ゲノムのwonderi　ng　・一　spo　tやcDNAの解析
では5’GGUAUUであるのでWTVのゲノムの51末端は分かっていない
　　　　　　　　　　　　　　　le
鍛
噛
巴＿，＿
（Nuss　and　Dall，1990）。RRSVに関してはYan（1992）がRNA
primer　sequence法でS9の転写産物の5t末端にキャップ構造の存在
を示唆している。
　1982年、Cashdollar　et　a1，はReovirus（Dearing株）のS2の
塩基配列の決定に際して、dsRNAから相補鎖DNA（complementary
DNA：cDNA）を合成し、　dsDNAにしてプラスミドベクター（pBR322）
に組み込む方法を開発した。また、1983年にはGubler　and　Hoffman
がmRNAを鋳型として効率的にcDNAを合成する方法を確立した。既に、
1977年、Sanger　eta1．が酵素的な手法によって、また、同年、
Maxam　and　Gilbertが化学的分解法によって効率的なDNA塩基配列決
定法を確立しており、これらを利用して植物レオウイルスの遺伝子構
造の解析が始まった。1985年、Asamizu　e亡al．はdsRNAを鋳型とし
てCashdollar　e亡al，（1982｝の方法でWTVのS4－S12の全長クローン、
Sl－S3の部分クローンを得、　S12の全塩基配列を決定した。更に、
wandering－spot解析でセグメントの末端塩基配列を決定し、その結
果、WTVの各セグメントに共通の塩基配列（＋）5t　GGUAUU・・…　UGAU
3iが存在することを明かにした。　RDV、　RGDV、　RBSDVのセグメント及
び、MRDVの一部のセグメントにおいてもそれぞれ末端領域の共通配列
の存在が示された（Kudo　etal．，1991；Marzachi　etal．，1991；
Azuhata　etaL，1992）。RRSVにおいてはYan　etal．（1992｝が
（＋）5i　GAUAAA・◆…　GUGC　3tであることを示した。　Anzola　eta1．
　　　　　　　　　　　　　　　　H
屡
屡
凝
J　旛　’
囲」＿i．，．．．．．．一．．．．．．一
蓋
（1987）は干渉性欠陥粒子（DI）のS5は末端塩基配列を残していたこ
とを示し、また、XU　e亡ai．（1989）はS8の末端のパンハンドル構造
を壊すことで発現効率が上昇することを示し、これらの末端共通配列
はウイルスゲノムの複製、タンパク質発現、セグメントの格納などの
機能に重要な役割を果たすことを示した。
　植物レオウイルスのゲノムの塩基配列に関しては現在までにRDVで
全セグメントが決定されており（Uyeda　eta1．，1994）、WTVでは
S4－S12　（Asamizu　et　al，，　1985；　Anzola　et　al．，　1987；　Anzela
e亡al。，1989；Xu　e亡aL，1989：Dall　eta1．，1989）、RGDVで
群まS8－SlO　（Koganezawa　e亡a1．，　1990；　Noda　et　a1．，　1991a）　、
RBSDVではS7、S8、S10（Uyeda　e亡a1．，1990a；Azuhata　et　al．，
1993）、MRDVではS6（Marzachi　e亡al．，1991）、RRSVではS9とSlO
が決定している（Uyeda　eta1，，1995a；Yan　e亡a1．，1995）．近
年、膨大な塩基配列の決定が要求され始め、Sanger　eta1，（1977｝
の方法を改変した反応とコンピューター解析を組み合わせたシークエ
ンサ”一’・”が開発された（Smith　eta1．，1986）。RGDVのS8－SlOはこれ
を利用して決定された（Koganezawa　e亡a1．，1990；N。da　etal．，
1991a）。更に、日本の各地から分離したRDV株にはゲノムの電気泳動
で区別できる変異性が認められた。それらのRDV株ではS12の塩基配列
が比較された（Murao　etaL，1994）。動物に感染するreovirusや
r。tavirUSでは遺伝的再集合によりセグメントが交換する現象が知ら
　　　　　　　　　　　　　　　12
鋤
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難
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．
　
鰯
灘
一
応
灘
．
・
難
圃」Ph一一．．．L＿＿細
れていたが、RDVでは2種類のウイルスを媒介昆虫に注射することでそ
の現象が確かめられた（Uyeda　e亡a1．，1995a）。
　これまでにRRSVでは感染特異的タンパク質の報告がない。しかし、
純化ウイルス粒子で7種類のタンパク質がPAGEによって確認されてい
る。また、MgC12処理でスパイクを分解することにより粒子表面に2種
類のタンパク質が存在することが示された。　（河野，1984；
Hagiwara　et　aL，　1986；　Chen　et　aL，　1989b；　Yan，　1992）　．
RDVでは各セグメントにコードされているタンパク質が罹病イネと保
毒媒介昆虫の両方で発現されていることが確認された（Suzuki　e亡
al．，1994；村尾，1994）。RDVはそれらのうちS1、　S2、　S3、　S5、
S7、　S8からの翻訳産物で粒子が構成されている（Suzuki，1995）。
WTVではヨコバイの培養細胞を利用して感染特異的タンパク質が検出
され（Nuss　and　Peterson，1980）、ゲノムのcDNAクロ”一・・”ンを用い
てS4－S12とそれらのタンパク質の対応関係が明らかにされた
（Asamizu　et　al．，　1987；　Xu　et　aL，　1989）　．
　昆虫で媒介をせずに宿主中で長年保持し続けた植物レオウイルスは
昆虫伝搬性を失うことがある（Reddy　and　Black，1974；Kimura，
1976）。昆虫伝搬性を失ったWTVのS2、　S5、　S7に変異が起きていた。
S7では不完全であったが、　S2とS5でそれぞれ変異セグメントに完全に
置き換わった変異株が得られた。変異したS5は5’末端より319塩基、
31末端より205塩基を残して中問が欠損していたにもかかわらず、ウ
　　　　　　　　　　　　　　　13
醗
’
イルスの複製は可能だった（Anzola　e亡al．，1987）。同様に昆虫伝
搬性を失ったRRSVのゲノムの解析ではSlOに変異が起きていることが
示唆された（Maoka　etal，，1993）。
4．Oryza　virus属のウイルス
　植物レオウイルスの中ではEch　in　ochloa　ragged　stunt
Oryz　a　vi　rus（ERSV）のヒエでの病徴がRRSVに類似しており、また、
RRSVと血清学的関係があること、セグメントと構造タンパク質のPAGE
における分離パターンがそれぞれ似ていることが報告された（Chen，
1985；Chen　e亡a1．，1989b）。Yan　eta1．（1994）が示したERSV
のセグメントの末端共通塩基配列は5響GAUAAAU・・…　GGUGC　3’で
RRSVの末端共通塩基配列とほぼ一致している。しかし、媒介昆虫にお
いてRRSVはトビイロウンカ、　ERSVはSogate〃a　longifu　rci　feraと異な
る・また・ERSVの粒子形態は2重殻でAスパイク様のスパイクを持つこ
とからRRSVよりはFf／fvfrHs属の粒子形態に近い（Chen　et　a1．
1989a）。更に、　RRSVはトビイロウンカでヒエに伝搬しなかった
（Yan，1992）。これらのことからERSVとRRSVは異なるウイルスで
ありながら、非常に近縁なウイルスとされ（Chen　eta1．，
1989a）、Oryza　virus属に分類された。また、コロンビアのコムギで
発生したNarino　dwarf病でレオウイルス様の粒子が認められ、　PAGE
14
懸灘懸雛灘灘鑛1灘一一．
灘囎・　ll．”」t一
k・’f’　’h’nST1　makh．te－es．　SrfRYi
　　　　．，．一一一一・一一“．一一
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におけるセグメントの分離パターンがRRSVに似ていることから病原ウ
イルスと考えられるNarino　dwarf　virusがOryza　virus属に分類さ
れる可能性がある（Uyeda　and　Milne，1995）。
15
懸二一灘羅’1．懸，
．．．．．．一一一一‘
皿．材料と方法
（以下で使用する試薬類と基本的な実験操作は付録を参照のこと）
1．ウイルス源と媒介昆虫
　イネラギッドスタントウイルス（RRSV）は1977年に国際イネ研究所
（lnternational　Rice　Research　Institute；IRRI）より譲り受
け、北海道大学（北大｝の温室にてイネで継代してきたもの（RRSV－
H）と・IRRIで継代してきたものを1992年に北大に移したもの
（RRSV　一一　P）を用いた．トビイロ：ウンカは同様に北大で継代してきたも
のとIRRIで継代してきたものを北大に移して用いた。また、イネの品
種は金南風を用いた。
2．RRSV粒子の純化
　抽出緩衝液はGMT｛0．1Mグリシン、0．OIM　MgC12、0．02M　Tris－
HC1（pH7・5）｝あるいはリン酸緩衝液｛0．1M　KH2PO，に0．IM
Na2HPO4・12H20を加えて最終のpHを6．0にした｝を用いた。　RRSV罹病
イネ1009をlcm2ぐらいに刻み、緩衝液100m1を使用してミート
チョッパーで3回程ひいた。ガー’一’…ゼで粗抽出液を絞り、最終的に30％と
なるように四塩化炭素を加えてポリトロンホモジナイザーで5分間混合
　　　　　　　　　　　　　　　16
，，一．．一一．一d，．．b
した。6，000rpmで25分間遠心分離後（マルサン低速遠心分離機と9B
ロ：一夕一を使用）・上層をとって3％量のトリトンX－100をゆっくり滴
下し・4－8℃で30分以上スターラーで一式した。40PAチューブを用い、
40％ショ糖／緩衝液溶液を試料の下に注射器で下図のようにゆっくり
注入したe
　　　　　　　　　　　注射器の先につけた細いビニール管
4℃で25，000rpm、90分間遠心分離：した（日立65P超遠心分離機あるい
は70PとRPS27ロ：一心ーを使用）沈澱を緩衝液2mlに溶かした。テフ
ロンホモジナイザー一で3分間ホモジナイズし、卓上遠心分離機にて4℃
で8，000rpm、2分間遠心分離した上清を20％一50％ショ糖密度勾配カ
ラムにのせた・ショ糖密度勾配カラムはニトロセルロースチユー．…一・一ブを
用い、前日に下図のように注射器で作成した。
4℃で22，000rp皿、2時間遠心分離し（日立65P超遠心分離機あるいは
70PとRPS27ロ…一・・li二一を使用）、ISCOフラクショネー一夕一でウイルス
を回収した。ウイルス量が少ない場合はこのまま保存した。多い場合
17
、・
@灘灘鑛三三灘、灘購
　　　　　　　　　　腿懸騨　　　　蝿，“　’
．．．．．．一一“，，
は12PAチュ・一…’‘ブを使用し、4℃で40，000rpm、1時間超遠心分離した
（日立70P超遠心分離機とRPS65アングルローターを使用）．OD26。の
吸光度を測定してウイルス濃度を算出し、一80℃で保存した。
3．　Enzyme－linked　immunosorbent　assay　（ELISA）
　RRSV粒子に対する抗体を精製して3μg／m1となるように0，05M　炭
酸ナトリウム緩衝液（pH9．6）で希釈した溶液をプレ目口ト（NUNC社外、
Maxi　sorp　8×12ウェル）の各ウェルに200μ1ずつ入れて37℃で3時
間保温した・緩衝液を捨てて0．02M　PBS－Tweenを1ウェルにつき200
μ1入れ、3分間静置してから液を捨てるという操作を3回繰り返した
　（洗浄）　｛プレートの洗浄には0．02M　PBS－Tween（pH7．4）を使
用｝。試料を200μ1ずつウェルに入れ（1試料につき2反復した）、4
℃で一晩静置した。試料を捨てて洗浄し、冷蔵保存してあるRRSV粒子
に対するアルカリフォスファターーゼ結合抗体（希釈倍数試験済み）を
0．02M　PBS－Tweenで400倍に希釈し、1ウェルにつき200μ1入れて37
℃で3時間保温した。プレ・一・・一トを洗浄後、基質溶液｛1mgP－
nitrophenyl　phosphate／ml　10％Diethanolamine（pH9．8）｝を
1ウェルにつき200μ1入れて室温あるいは37℃で発色が確認できるま
で（1時間一3時間）保温した。各ウェルはMTP－100マイクロ：プレ＿
トリーダ（コロナ電気社製）によって波長415nmの吸光度を測定し、
陽性と陰性を判定した。各プレートには0，02M　PBS－Tween、陽性試料
18
灘 諺　畿
　
、
嚇
腿
濁
　
　
託し
曇
瀦
．，．．．．．．．．J．，一一し
としてRRSV罹病イネ・陰性試料として健全イネ、トビイロ：ウンカの場
合は更に無毒トビイロウンカ試料を用いたウェルを用意した。イネの
場合は塩化ナトリウム40g、　KH2PO、1g、　Na2HPO、・12H2014．5g
塩化カリウム19・NaN31gを混合して滅菌水で11としたものを保存
緩衝液（0．IM　PBS）とし、使用時に滅菌水で5倍に希釈して11あたり
Tween　20を0．5ml加えた｛O．02M　PBS－Tween（pH7．4）｝。イネは
生葉重の5倍量の緩衝液｛0．02M　PBS－Tween（pH7．4）｝を加えて乳
鉢で磨砕し・マイクロ遠心チューブに移し、12，000rpm、1分間遠、亡、
分離し、上清をELISA試料とした。
　トビイロ：ウンカの場合は塩化ナトリウム40g、　KH，PO、11，34g、
Na2HPO4・12H2014．5g、塩化カリウム1g、　NaN，1gを混合して滅
菌水でllとしたものを保存緩衝液（0．IM　PBS）とし、使用時に滅菌
水で5倍に希釈して11あたりTween　20を0．5ml加えて使用した
｛0・02M　PBS　一一　Tween（pH6・5）｝。一80℃でマイクロ遠心チュ・．一・一・一ブ中
（1つのチューブにつき1個体）に保存してあったトビイロウンカを氷
冷しながら1×STE　180μ1を加えてペッスルあるいは楊子で磨遷し
た・磨砕液は卓上遠心分離：機にて12，000rpmで1分間遠心分離し、上
清の36μ1をマイクロ遠心チューーブに移して緩衝液｛0．02MPBS　一一
Tween（pH6．5）｝365μ1で希釈してELISA試料とした。
4．罹病イネからのRRSVゲノムの抽出
19
・t’，，，r1．灘購
　
瀞
嬬
黎
懸
隔
翻
螢
婿
一
　2－39のRRSV罹病イネを細かく刻み、50ml用の遠沈ガラスチュ＿ブ
に入れ・1×STE　15m1．20％SDS　O．75m1、メルカプトエタノ＿ル
0・15m1・フェノール7・5ml、クロ1ロフォルム7．5m1、ベントナイト
0・059を混合して・ポリトロンホモジナイザー一で室温で3－4分間磨卜し
た・SAKUMA　Mode190－22で2，500rpm、15分間、7℃で遠心分離し、
水層を移して・フェノール9m1とクロロフォルム9m1を加え、ヴォ
ルテックスで3分間混合して、同様に遠心分離した。再び水層を移して
エタノール沈澱し、TE　3m1に溶解した後、4M　LiCl　3m1を混合し、
一晩氷冷した。溶液は50m1用ナルゲンチューブに入れ、6Bロ　一一夕一・一・…一を
使用してSakuma　Model　M－160で10，000rpm、15分間、4℃で遠心分
離し、上清を移してエタノール15皿1だけを混合してエタノール沈澱
した。沈澱を滅菌水400μ1に溶解し、再度工タノー・一・一・‘ル沈澱した後、
1×STE　400μ1に溶解し、エタノール200μ1とCC4、（Whatman社
製CELLULOSE　POWDER）50皿gを加えて30分間ヴォルテックスで混
合した。卓上遠心分離機でIO，　OOOrpm、1分間遠心分離し、上清を捨
ててCC41の沈澱に1×STE　400μ1、エタノール200μ1、メルカプト
エタノール60μ1を加え、15分間ヴォルテックスで混合し、同様に
遠心分離してから上清を捨てた。1×STE　400μ1と工タノPtル100
μ1を加えてヴォルテックスしてから遠心分離をする操作を3回繰り
返した後、エヴァボレーターで5分間、CC41を乾燥させてから、200
μ1の滅菌水に懸濁した。遠心分離してCC41を除き、上清をエタノール
沈澱して10－20μ1の滅菌水に溶解し、抽出試料とした。
20
　　　　　　μ蹴笛　　　獄 　繋鍮、
1i，，，，一・一・一一一‘．一一
5・トビイロウンカからのRRSVゲノムの簡易的抽出
　ELISAに供試した残りの1×STE磨砕液144μ1に0．05gベントナ
イト／ml　1×STE溶液10μ1、20％SDS　7，5μ1、メルカプトエタノー
ル1・5μ1・フェノーール75μ1、クロロフォルム75μ1を混合して
10分問ヴォルテックス後、卓上遠心分離機で室温、12，000rpm、5分
間遠心分離した・上層をとってエタノール沈殿し、滅菌水50μ1に
溶解して抽出液とした。
6．RRSVゲノムのSDS－PAGE
　泳動緩衝液には0・05M　Tris、0．38Mグリシン、1％SDS溶液、泳動
槽はマリソル社製スラブゲル電気泳動装置を用いた。ゲルの組成はタ
ンパク質のSDS－PAGE（方法20．）同様であるが、ゲル板は16×16×
0．1c皿を用いた。30％アクリルアミド保存溶液8．325m1、20％SDS
O．125m1、3M　Tris－HCI（pH8．93）125m1、滅菌水13。275m1を混
合してSeparation　gel溶液とし、10％APS　250μ1、　TEMED　l2．5
μ1を混合してゲル板の上端から約2cmの位置まで流し込んでゲル化
させた。30％アクリルアミド保存溶液lml、20％SDS　O．05ml、
0．5M　Tris－HC1（pH6、7）1．25m1、滅菌水7，59m1を混合して
Stacking　gel溶液とし、10％APS　100μ1月目EMED　5μ1を混合し
21
懸灘三白羅，．山山羅 溝一
i．．．．．．．．．．．・db．
てゲル化させ・2層のゲルを作製した。試料に等量の2×緩衝液｛0．IM
Tris－HCI（pH6．7）、2％メルカプトエタノール、4mM　EDTA、20％
グリセロ：一ル｝と泳動用色素液を混合してゲルにのせ、100V定電圧で
電気泳動した（RRSVゲノムは通常、約20時間）。泳動後、核酸を検出
するため、ゲルをアガローースゲル同様に0．5μg／ml　EtBr溶液で染色
（方法17．）あるいは銀で染色した（方法8．）。
7．　PAGE　（SSCP）
　SSCP解析の場合は10×TBE（0．9M　Tris、0．9Mほう酸、40mM
EDTA・最終のpHは8・3）を希釈した0．5×を電気泳動緩衝液とし、泳
動槽はマリソル社主スラブゲル電気泳動装置を用いた。ゲル板は16×
16×0．lc皿を用い、30％アクリルアミド保存溶液6m1、10×TBE
1・5m1・グリセロールLsm1、滅菌水20，8mlを混合し、フィルタ＿
濾過後、10分間脱気して10％APS　200μ1とTEMED　20μ1を混合し
てゲル板に流し込み、コームを差し込んで1時間以上静置してゲルを作
製した。室温にて5mA定電流で予備通電後、試料をつんでBPBが流出す
るまで電気泳動した。
8．銀染色（核酸）
電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを固定溶液（10％エタノール、
22
0・5％酢酸）に入れて10分間振蛋した後、固定溶液を入れ換えて再度
10分間振面した。固定液を12mM硝酸銀溶液【｛N／10　Silver
nitrate　solution（Nacalai社製）｝36mlに滅菌水264mlを混
合して作成】に換えて15分国振濾した後、溶液を除いて滅菌水で軽く
すすいだ。ゲルを現像液（375mM水酸化ナトリウム、2，3mM　NaBH
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4s
O．4％HCHO）に入れて軽く振敵し、適当な染色像が得られたら、液を
除いて定着液（0・07M　Na2CO3）を入れて10分間振盗した。ゲルは3MM
紙（Whatman社製）に移し、1時間乾燥機にかけてから保存した。
9・コロ：ニーーハイブリダイゼーション
①塩化カルシウムによる大腸菌の形質転換
　LB寒天培地（10mg／撮l　Tryptone、5mg／ml　Yeast　extract、
10mg／m1塩化ナトリウム、1．5％Agar）上の大腸菌HBIO1の単コロニー
をLB液体培地lmlに接種して37℃で一晩振塗培養した。培養液400
μ1を新たなLB液体培地40m1に接種して37℃で90－120分間振盗培
養し（ヘネロフラスコを使用）、OD55。が約0．4（0．2－0．6）になった
ところで培養を止めた。培養液を遠心分離して集幽し（50m1用ナルゲ
ンチュ・一・一…ブに入れ、6Bローター…一を使用してSakuma　Model　M－160で
4，000rp皿、5分間遠心分離｝、沈殿を塩化カルシウム溶液｛50mM
CaC12、　10mM　Tris－HC1（pH8．0）｝15m1に穏やかに懸濁した。15
分間氷上に静置後、再び集菌し、塩化カルシウム溶液2m1に懸濁し
23
、　’薗
た（コンピーテントセル）。コンピーテントセル100μ1にpBR322
由来の各プラスミド保存液（濃度は不明）0．5μ1を混合して42℃で1
分間熱処理後・LB液体培地100μ1を混合して12，5μ9／mlテトラ
サイクリンを含むLB寒天培地上にまいた。室温で数分間乾燥後、一晩
37℃中で、形質転換した大腸菌のコロ：ニー一を形成させた。
②プラスミドのナイロンメンブレンへの吸着
　12・5μ9／m1テトラサイクリンを含むLB寒天培地に各形質転換体を
分けるための枠を引いたナイロンメンブレンを敷き、その上にそれぞ
れの形質転換大腸菌をストリークして37℃で一晩大腸菌を培養した。
大腸菌側を上にしてナイロンメンブレンを室温で10分問乾燥後、0．5％
SDSを含む2×SSCに浸した濾紙上に3分間静置して溶液を浸透させた。
大腸菌タンパク質を変性させるためにナイロンメンブレンをシャ＿レ
に移して1分間電子レンジ（960W）にかけ、0，1％SDSを含む5×SSC
溶液に浸した。大腸菌タンパク質は綿棒でこすうて完全に除去した。
ナイロンメンブレンは同溶液で洗浄を繰り返してから2×SSC緩衝液で
軽く洗浄し、室温で乾燥させてデシケー’・’S夕一…一・一で保存した。
③プロ・一・一・・ブの作成
　RRSVゲノム10μ9のTE溶液に泳動用色素を加え、5μ9／レーンで
5％PAGEに供試した・PAGEは以下の条件で行った。30％ポリアクリル
アミドゲル保存溶液5m1と10×TAE（0．4M　Tris、0．2M酢酸ナト
24
灘・灘　　鑛灘
i，，，．J一・一一．一一
リウム、0．02M　EDTA、約2％量の酢酸でpH7－8に調整）3m1、滅菌水
2L8mlを混合し、10分間エヴァボレー・…一・‘夕一で脱気後、10％APS　200
μ1とTEMED　20μ1を混合して、ゲル板（0．1×16×16cm｝に流し込
んだ・ゲルは1時間以上静置して作成した。1×TAEを電気泳動の緩衝
液とし・マリソル社製スラブゲル電気泳動装置を用い、40mA定電流で
30分問予備通電後、泳動用色素を混合したゲノムをつんで、約11時問
電気泳動した。ゲルを0．5μg／ml　EtBr溶液中で10分間以上緩やかに
振記してから紫外線照射下（トランスイルミネーター・・一上）で各セグメ
ントの位置を確認した。各セグメントの位置のゲルをマイクロ遠心
チュ・一一’・tブに切り出してガラス棒で磨狂した。但し、ゲルが吸着しない
ようにマイクロ遠心チューブとガラス棒はドラフト中でジクロロシラ
ン蒸気にあてた後、流水で良く洗浄し、更に蒸留水で洗浄してからオー
トクレーブしたものを用いた（シリコン処理）。ゲル片を核酸溶出用
緩衝液（0．5M酢酸アンモニウム、0．1％SDS、　lmM　EDTA）に懸濁し、
一晩振点した・溶液はゲル片を除くために1m1用のマイクロピペット
チップにつめたグラスウール（シリコン処理済）を通過させた（卓上
遠心分離機で2，000rpm、5分間遠心分離した）。回収した溶液の2．5
倍量のエタノール（この場合はエタノールのみ）を混合して工タノs．．．．．一
ル沈殿した・ゲノムの5’末端の構造は明らかではないが、一一応、リン
酸基を除く操作をした。沈殿を滅菌水44μ1に溶解し、10×Calf
intestine　alkaline　ph。sphatase（CIP）用緩衝液5μ1とCIP
（20units／μ1）　（ベーリンガー・マンハイム社製｝1μ1を混合し
25
＿　　羅懸灘i一白　野『
て50℃で30分間保温後、再度CIPlμ1を混合して同様に保温した。
20％SDS　2・5μ1とIM塩化ナトリウム5μ1を混合して反応を止め、
滅菌水で100μ1としてからフェノール・クロロフォルムで抽出した。
5i末端を32Pで標識するため、2回以上エタノール沈殿した核酸を滅菌
水33μ1に溶解し、10×Kinase用緩衝液｛0．5M　Tris－HC1
　（pH7．5－8．0）　、0．1M　MgC12、0．05M　DTT｝5μ1とγ32　PdATP（ICN
社製）5μ1（50μCi）とT4　Polynucleotide　Kinase（宝酒造社製）
2μ1を混合して60分間37℃で保温した。フェノール・クロロフォル
ムで核酸を抽出した後、未反応のγ32PdATPをゲル濾過で除いた。ゲル
濾過用のカラムを作成するため、0．5ml用マイクロ遠心チューーブの底
に穴を開け、減菌した綿を敷いて、G－50のTE溶液を適当量入れた。穴
から出る溶液を受けるための1．5m1用マイクロ遠心チユー・一・一・・一ブを付けて
卓上遠心分離機で5，000rpm、90秒遠心分離し、　TEを除いた。等量の
TEを加えて遠心分離する洗浄操作を数回繰り返した後、　TEに溶解した
核酸を入れ・遠心分離で下のLsm1用マイクロ遠心チューーブに回収さ
れた核酸溶液をプローーブとした。プローブは1μ1を液体シンチレ＿ショ
ンカウンター（Aloka社製）にかけて32P活性を測定し、105cpm／ml以
上で使用した。
④ハイブリダイゼーション
　作成したナイロンメンブレン（約43cm2）を耐心用のビニ＿一ルバッ
クに入れ・プレハイブリダイゼt・一・一・・一ション溶液｛50％ホルムアミド、
26
．灘灘灘三二1
魑・ �?　　　　　　買∵
5XSSC．　50mM　NaPO，　（pH6，　7）　．　500］Lt　g／ml　tRNA．　O．　1％　SDS．
5×Denhard‘s　solution｝3－4m1を入れ、気泡を除いてポリシーーラ＿
で口を閉じ・42℃で2時間保温した。プレハイブリダイゼーション溶
液はハイブリダイゼーション溶液に換え、45℃で13時間保温した。ハ
イプリダイゼーション溶液はプローブを95℃で10分間熱処理後、急冷
して変性させ、新たなプレハイブリダイ前脚ション溶液1皿1に混合
して作成した。未反応のプロ…一’・1ブを除くため、ハイブリダイゼーショ
ン後、ナイロンメンブレンを0．1％SDSを含む2×SSC溶液100皿1に
入れ、室温で10分間緩やかに振盈した（洗浄）。再度同溶液で洗浄を
繰り返した後、0．1％SDSを含む0．2×SSC溶液に換えて、60℃で20分
間洗浄した・ナイロンメンブレンは乾燥させてからオートラジオグラ
フィーにかけて反応を検出した。
10・ドットプロットハイブリダイゼーション
①セグメントのナイロンメンブレンへの吸着
　RRSVのゲノム12μ9を2レーンに分けてSDS－PAGEに供試し、各セ
グメントを分離した。24時間で泳動用緩衝液を新しいものに換え、全
体で48時間泳動した。0．5μg／ml　EtBr溶液中で10分間以上緩やかに
振塗してから紫外線照射下（トランスイルミネータ川上）で核酸を確
認したところ、S7とS8が流出していたため、　S1、　S2、　S3、　S4だけを
抽出した（方法15．）。再度RRSVのゲノム2μgを同様に全体で31時
27
鐵
問電気泳動して、S7とS8を得た。各セグメントは滅菌水に溶解して
1／10量をSDS－PAGEに供試し（方法6．）、ゲルの銀染色をして分離で
きたことを確認した（方法8．）。残りの試料を10×SSC溶液とし、
100℃で5分間熱処理後、急冷して変性させた。抽出した量に対してSl、
S2・S3・S4は約1／25量、　S7とS8は1／5量を原液としてlcm2枠のナイ
ロンメンブレンにスポットした。変性した試料を冷10×SSCで希釈し
て同様にしてスポットした。ナイロ：ンメンブレンの下には濾紙を敷き、
一回に2μ1で数回に分けてスポットした。ナイロンメンブレンは風乾
後・0・05N水酸化ナトリウムを染み込ませた濾紙上に5分間静置した。
更に、1分間2×SSC中で洗浄してからGS　Gene　Linker（パイオラッ
ド社製）　C－3Program（150mJ｝で処理し、風乾してデシケータ．．．．一‘一
で保存した。
②プローブの作成（ランダムラベリング法）
　Pst　1で切断したプラスミド75ngとランダムプライマー一
9．6pmo1（Hexadeoxynucleotide　dp（N）6宝酒造社製）の混合液5
μ1を100℃で3分間処理後、急冷した。試料1μ1にdCTPを除く
0．5m超dNTP　O．5μ1、10×Klenow緩衝液｛0．5M　Tris－HC1
（pH7．5）　．　O，　IM　MgCl，　．　10mM　DTT．　O．5mg／ml　BSA｝　O，5Lt　1．
2units／iu　l　Klenow　fragment　4ul．　a　32PdCTP　（6，000Ci／
mmol）　（アマシャム社製）1μ1（loμCi）、滅菌水1，6μ1を混合
して37℃で2時間保温後、0・5MEDTAO．2μ1を混合して反応を停止
28
11h．．．bL
させた・反応しなかったα32PdCTPを除くため、ゲル濾過をした。
Sephadex　G50（ファルマシア社製）のTE懸濁液を下にグラスウール
をつめたパスツt・一・一・一ルピペットに注いでカラムを作成し、上から0，1％
SDSを含むTEを注いで下から溶液が出る状態にした。反応液に泳動用
色素2μ1を混合してカラムにつんだ後、0，1％SDSを含むTEを100
μ1つつ入れて行き、サ・・一・一・Lベイメーターで測定しながら2つに分かれた
ピークのうち、最初に出てきたピークを分取してブロー一・一・一ブとした。プ
ローーブは1μ1を液体シンチレ・・一・一・一ションカウンター（Aloka社製）にか
けて32P活性を測定し、106cpm／m1以上で使用した。
③ハイブリダイゼーション
　コロニーーハイブリダイゼーション（方法9．）と同様に、ハイブリダ
イゼー…一・・ションを行った。但し、プレハイブリダイゼー一・一ション溶液は
tRNAのかわりに40μg／ml　Salmon　sperma　DNA（和光社製）を使用
した。
11．サザンプロットハイブリダイゼーション
①ゲルからナイロンメンブレンへ核酸の転写
　L5％アガロースゲル電気泳動後、0、5μg／ml　EtBr溶液で染色し
て核酸を確認した（方法17．）。ゲルは0．4N水酸化ナトリウム、　IM
塩化ナトリウム溶液に入れ、15分間室温でゆっくりと振盈した。ナイ
29
ロンメンブレンは滅菌水に浸した後：、20×SSCに数分間浸した。0，4N
水酸化ナトリウム、IM塩化ナトリウム溶液に浸漬したトランス
ファー一・・用プロ：ックの上に、3MM紙（What皿an社製）、ゲル、ナイロ：ン
メンブレン・3MM紙ペーパータオル、重しを順番に積み上げ、1－2時
問核酸をナイロンメンブレンに転写した。ゲルを再びEtBrで染色して
核酸がトランスファー一したことを確認した。ナイロンメンブレンは
0．5M　Tris－HCI（pH7．2｝、1M塩化ナトリウム溶液に15分間浸した
後、室温で乾燥し、更に、80℃で2時間処理した。
②プロ　一一ブの作成
　ドットプロッティングと同様にランダムラベリング法で作成した。
但し、Random　labeling　kit（宝酒造打製）を用い、緩衝液は添付
のもの・アイソトープはα32PdCTP（3，000Ci／mmol）　（アマシャム社
製）5μ1を使用し、全体量25μ1の反応液として説明書に従って反
応させた・プローブはSephadex　G50（ファルマシア社製）カラムで
精製して1×106cpm／mlに相当する量で使用した。
③ハイブリダイゼー一・■ション
　コロニーハイブリダイゼーションと同様に、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。但し、プレハイブリダイ回田ションは40℃で2－3時間と
し、プロ・一一ブは90℃、4分間熱処理後、急冷して用いた。ハイブリダ
イゼt・一・一一・ションは45℃で一晩行った。
30
．、。難灘灘懸
躍
灘一叢
，
鐙
1蟹
11L．一一
　　　ゼ
12，DMSO変性
　dsRNA試料（水溶液）5μ1にDMSO（気体の窒素を0，5－1分間通し
たもの）50μ1を混合し、50℃で30分間保温、した後、一80℃工タノS・一・一’一
ルで急冷して固化させた。3M酢酸ナトリウム5μ1とエタノール
150μ1を混合して、エタノール沈澱し、DMSO変性試料とした。
13．逆転写反応（M－MLV逆転写酵素）
　DMSO変性したゲノムの沈殿をプライマー（0，5μ9／μ1）1μ1と滅
菌水8．5μ1の混合溶液に溶解し、更に、2．5mM　dNTP　4μ1、0．IM
DTT　2ul．　5XM－MLV　Reverse　Transcriptase　reaction　buffer
（GIBCO　BRL）　4ul．　M－MLV　Reverse　Transcriptase　（GIBCO
BRL）　（200units／μ1）o．5－1μ1を混合して37℃で30－120分間保
温した。
14，　Polymerase　chain　reaction　（PCR）
　2．5皿MdNTP　8μ1と10×Tthポリメラーゼ緩衝液（東洋紡績社製）
10μ1・プライマー一’　1（0・5－1μ9／μ1＞2μ1、プライマー2（1μ9／
μ1）2μ1、Tthポリメラーゼ（4－6units／μ1）　（東洋紡績社製）2
31
W
酵
陸．．　・
瓢　『　　　zat’”
一））））一一・一一一一一
　　　s
　　　il
　　　lii
，u　L鋳型の混合液を滅菌水で100μ1とした。また、全体量が50μ1の
場合は各試薬、酵素を半分量にした。反応液の蒸発を防ぐためにミネ
ラルオイルを一滴加えてからプログラマブル　テンプコントロールシ
ステムPC－700（アステック社製）にセットして以下の条件で温度を
変えた。
S9の全長dsDNAの増幅
94℃1分間、55℃2分間、72℃3分間を30サイクルして25℃で終了。
SSCPのためにS9の部分的増幅
94℃1分間、57℃1分間、72℃2分間を25サイクルして（最後のサ
イクルの72℃は10分間とした）から57℃、40℃、30℃をそれぞれ10
分間ずつ行って25℃で終了。
pMALに挿入するためのS90RFの増幅
95℃1分間、55℃0．5分間、75℃4分間を25サイクルして25℃で終
了。
pMALに挿入するためのS10の主要なORFの増幅
94℃1分間、55℃2分間、72℃3分問を25サイクルして（最後のサ
イクルの72℃は10分間とした）から55℃、40℃をそれぞれ5分間ずつ
行って25℃で終了。
pUCI19に挿入するためのSlOの小さいORFの増幅
94℃1分間、55℃2分間、72℃3分間を25サイクルして（最後のサ
イクルの72℃は10分間とした）から55℃、40℃をそれぞれ2分間ずつ
行って25℃で終了。
15・サブクローニングとDNAの平滑末端化
①プラスミドに挿入するDM断片の調整
32
1” @　・躍．，　　麗 簸
ihb）一一一一一・・”’Vpt
　　　l
　　　t
　　　v
1
　
　
1
　制限酵素処理したDNA試料はエタノー一・一・・ル沈殿後、必要に応じて平滑
末端化した・1－3μ9のDNA　l5μ1に5×T4　DNAポリメラーゼ緩衝液
　｛335mM　Tris－HC1（pH8．8）、38．5mM　MgC12、50mMメルカプト一
二ノール・33・5μHEDTA、83mM（NH、）、SO、、0．0835％BSA、
1．665mM　dNTP｝、4units／μlT4　DNAポリメラーゼ1μ1を混合
して37℃で1時間保温後、50mM　EDTA（pH8．0）5μ1を混合して反応
を止めた．滅菌水で反応液を50－100μ1としてからフェノール・クロ
ロフォルムで抽出し、エタノール沈殿した。制限酵素処理したDNA試
料1－3μgをそのまま、あるいはエタノール沈殿した試料は滅菌水5
μ1に溶解して5％PAGEに供試した。電気泳動は以下の条件で行った。
30％ポリアクリルアミドゲル保存溶液1，63mlと10×TBE
1・96m1・滅菌水19m1を混合し、10分間エヴァボレ一蓋ーで脱気後、
10％APS　lOOμ1とTEMED　l2．5μ1を混合してゲル板（0．1×
9．5×9．5cm）に流し込んだ。ゲルは1時間以上静置して作成した。電
気泳動の緩衝液は2×TBEとし、マリソル社製ミニスラブゲル電気泳動
装置を使用して100V定電圧で30分間予備通電後、泳動血色素を混合し
たDNA試料をつんで電気泳動した。ゲルは0．5μg／ml　EtBr溶液中で
10分間以上緩やかに振歯した。分離したDNA断片の位置は紫外線照射
下（トランスイルミネー一一上）で確認し、その部分のゲルを切り出
し・コロニーハイブリダイゼーションのプローブ作成と同様にDNAを
溶出してエタノール沈殿した。但し、ゲル片を除くためには、溶出液
をSuprecTM－01（卓上遠心分離機用限外濾過チューブ｝に入れて
33
雛嚢§
i，））一一一一．，．．．．一一一
　　　f
8，000rp皿で10分間の遠心分離を行った。
②プラスミドベクターの調整
　必要に応じた制限酵素で処理したプラスミドベクター2μ9は1／20
量をアガロースゲル電気泳動に供試して切断を確認した（方法
17．）。平滑末端化したPCR産物を挿入する場合以外は、すべてではな
いが、Calf　intestine　alkaline　phosphatase（CIP）で処理し
た。lo×clP緩衝液5μ1とcIP（20units／μ1）　（ベーリンガー・
マンハイム二三）1μ1を混合して5‘末端が突出している場合は37℃、
それ以外は50℃で30分間保温した。制限酵素あるいはCIPを失活させ
るために滅菌水で100μ1とし、フェノール・クロロフォルムで抽出し
た。プラスミドベクターは使用前にエタノール沈殿し、滅菌水20μ1
に溶解して用いた。
灘
劉
．
羅
・
、
懸
璽
．
鶴
・
　
　
　
　
③ライゲーション
　ブラスミドベクタ・・…一・・0．1－0．2pmo1と挿入DNA　O．1－0．2pmo1以上
を混合し、10×ライゲーション緩衝液2μ1、IOmM　dATP　1μ1、
5units／μ1T4　DNAリガーゼ（べ・一・一・tリンガー・マンハイム社製）1
μ1と滅菌水で全体量20μ1とし、16℃で8－24時問保温した。ある
いはDNA　Ligati。n　Kit　Ver．2（宝酒造社製）を用いた。プラスミド
ベクターと挿入DNAのTE溶液10μ1に等量の1液を混合して16℃で1
時間保温した。ライゲ・…一・・ション反応液の1／2量を大腸菌の形質転換に
34
用いた。
　
　
i
　　lri・
鵜懸白白．一回羅嬬’
④大腸菌の形質転換
　コ旧記ーハイブリダイゼーション同様に大腸菌JM109のコンピーテ
ントセルを用意した。但し、大腸菌の培養にはLBの代わりにSOB液体
培地（20mg／ml　Tryptone、5mg／ml　Yeast　extract、10mM塩化ナ
トリウム、2．5mM塩化カリウム、10mM　MgC1，・6H20、10mM　MgSO、・
7H20）、塩化カルシウム溶液の代わりに形質転換用緩衝液（35mM酢
酸カリウム、50mM　CaC12・2H20、0．008％酉乍酸、45mM　MnC12・
4H20・100mM　RuC1、15％しょ糖、最終のpHは5．8）を用い、40m1
培養液から最終的に形質転換用緩衝液2m1とした。コンピーテント
セルはDMSO　70μ1を混合して50μ1ずつ分注して一80℃で保存した。
コンピーテントセルとライゲーシヨン反応液を混合して氷上で20－30
分間静置した。42℃で1分間熱処理後、SOC液体培地（SOBに20mM　グ
ルコースを加えたもの）250μ1を混合して37℃で30分間保温した。
全量あるいは・一部を50μg／皿1アンピシリン（プラスミドベクターに
は抵抗性遺伝子がある）を含む2×YT寒天培地にまいて37℃で一晩保
温し、コロニー一を形成させた。また、LacZαを利用する場合は100mM
IPTGと2％5一プロ：モー4一クロロー3一インドリルーβ一Dガラクトシド
（X－gal）を予め培地上に塗布しておき、白色のコロニーを選抜した。
これらからプラスミドを抽出して目的の断片の挿入を確認した。
・・懇
35
i，bh一一一一．．．．．．．一一
　　　1／ll
　　　e
　　　r”
　　　1 16．大腸菌からのプラスミド抽出（アルカリ法）
　　　l　　　　pBR322の場合はテトラサイクリン（12．5μ9／ml）、pUC119の場合
　　1　　　はアンピシリン（50μg／皿1）を含む2×YT液体培地（16mg／ml
　　｝　　　Tryptone、10mg／ml　Yeast　extract、5mg／ml塩化ナトリウム）
　　　　　　　2m1に形質転換された大腸菌を接種して37℃で一晩振盗培養した
　　1　　　　（15m1用チューブにシリコ栓をしたものを使用）。大腸菌を集菌する
　　ii　ために駿台をマ伽遠心チx・一一ブに移レ卓上遠心分離機で
　　　　　　　8，000rpmで1分間（4℃）遠心分離した。沈澱をTEG溶液｛25mM
　　i　　　Tris－HC1（pH8、0）、10mM　EDTA（pH8．0）、50mMグルコース150
　　　　　　　μ1に懸濁して、10mgリゾチ・一…一，ム／ml　TEG溶液50μ1を混合した。
　　iii
　　l　5分間室温にて幽した後、Na・H－SDS溶液（。．2N水酸化ナトリウム、
　　　　　　1％SDS）200μ1を混合し、正確に5分間氷冷してから5M酢酸カリウ
　　　　　　ム溶液150μ1を混合した．10分間氷冷した後、遠心分離して上清を
　　　　　　移し、フェノ・・・・・・…ル・クロロホルムで抽出してから工タノー’・tル沈澱した。
　　　　　　沈澱は滅菌水49μ1に溶解し、0．1μg／μ1RNaseAlμ1を混合
　　1　　　して37℃で30分問保温後、2，498M塩化ナトリウムを含む20％（W／
　　l　　　V）ポリエチレングリコール6，000溶液30μ1を混合して1時間氷冷
　　i［
　　　　　　した。プラスミドは卓上遠心分離機で14，000rp皿（4℃）で10分間遠
　　　　　　心分離して沈澱させた。エタノール沈殿同様に等量の80％エタノール
　　1　でリンスしてから乾燥させ、5・一1・・μ1の滅菌水に溶解した．
　　i，
i）h．．一s．．．“b
　　　l
　　　l
　　　；
17．アガロ・一一スゲル電気泳動
　1×TBE緩衝液に分離する核酸の大きさに応じて1．0－2．0％量のアが
九州スを加え、熱を加えて溶解した。ゲルを作製するためにMupid－2
（コスモ・バイオ社製）の専用トレーに入れ、30分間以上静置した。
泳動槽にはMupid－2、緩衝液は1×TBEを用い、核酸試料を泳動用色
素と混合してウェルに入れ、100V定電圧で通電した。泳動後、ゲルは
0．5μg／ml　EtBr溶液中で10分間以上緩やかに振堂し、紫外線照射下
（トランスイルミネー・一一夕一上）で核酸を確認した。
　　　18．シークエンサーを利用した塩基配列の決定
　　　①　反応
　　　　培養液2mlからアルカリ法で抽出したプラスミド試料を滅菌水
　　　100μ1に溶解して鋳型試料とし、以下のように反応液を混合した。
　　　A反応　　　　　　　　　　　　　　　　C反応
　　　Tthポリメラーゼ　　1μ1　　　　　　Tthポリメラ・・一・・一・一ゼ　2μ1
　　　5×Tth緩衝液　　L8μ1　　　5×Tth緩衝液　1．8μ1
　　　鋳型試料　　　　　3．2μ1　　　　　　鋳型試料　　　　3．2μ1
　　　G反応　　　　　　　　　　　　　　　　T反応
　　　Tthポリメラーゼ　　1μl　　　　　　Tthポリメラーゼ　2μ1
　　　TAMRA　p一r．　il　m．　．er　2Lt　l　ROX　primer　2）u　l
　　　5×Tth緩衝液　　3・6μ1　　　5×Tth緩衝液　3．6μ1
　　　鋳型試料　　　　　6．4μ1　　　　　　鋳型試料　　　　　6．4μ1
　　但し、Tthポリメラーゼは希釈緩衝液で0．4units／μ1に調製し、
　　　　　　　　　　　　　　　　　　37
E））一一一一一・・一一’一J‘
Tth緩衝液は添付の10×のものを滅菌水で希釈して5×で使用した。プ
ライマーは市販のもの｛ApPlied　Biosystems（ABI）社製の一21M13
あるいはM13RP1｝を使用し、　A、　C、　G、　TMixの組成は以下の通りで
ある。但し、ddATP、　ddCTP、　ddGTP、　ddTTPはここで示した値の80％
濃度でも行った。
A　MiX
　ddATP
　dATP
　dCTP
C7一　dGTP
　dTTP
G　MiX
　ddGTP
　dATP
　dCTP
C7－dGTP
　dTTP
1275　Ju　M
　45　」u　M
234uM
351　／ct　M
234　2ct　M
128　，tct　M
156　be　M
156　iu　M
94　」u　M
156　，et　M
C　MiX
　ddCTP
　　dATP
　　dCTP
C7一　dGTP
　　dTTP
T　MiX
　ddTTP
　　dATP
　　dCTP
C7一　dG　TP
　　dTTP
248　Ju　M
156　p．t　M
32　」et　M
234　iu　M
156　］ct　M
960　，a　M
312　，u　M
312　，at　M
468　stt　M
20　，u　M
上記混合液にミネラルオイルを1滴加え、プログラマブル　テンプコン
トロールシステムPC－700（アステック社製）を用いて下記の条件で
反応させた。95℃で30秒保温、55℃で30秒保温、70℃で60秒保温を
15サイクルした後、95℃で30秒保温、70℃で60秒保温を15サイクル
して4℃で保存した。反応終了後、A、　C、　G反応液をTの反応液に集め、
軽く遠心分離してミネラルオイルと反応液を分離した。下層の反応液
を別のマイクロ遠心チュV・・…Lブに移し、冷エタノール200μ1と3M酢
酸ナトリウム6μ1を混合し、一80℃のかわりに10分間以上氷冷して
工タノーール沈殿した。すぐに電気泳動する場合はホルムアミド溶液
（ホルムアミド：50mM　EDTA・5：1の混合液）に溶解した。すぐに電気
　　　　　　　　　　　　　　　38
箋懸羅
鱒’
L一一一脚一一＿．
　　’
泳動しない場合は乾燥したまま一30℃で遮光して保存した。
②電気泳動
　シークエンサー（ABI社製型式370A）による電気泳動と解析はマニュ
アルに従った。6％ポリアクリルアミドゲルは尿素309、40％アクリ
ルアミド保存溶液9ml、10×TBE　6m1、滅菌水22．9mlを混合して
45－50℃の熱で尿素を溶解し、フィルター濾過後、10分間脱気して
10％APS　300μLTEMED　30μ1を混合し、シークエンサー専用のゲ
ル板に流し込んで作製した。但し、10×TBEはTris　108g、ほう酸
559、EDTA　8．39を混合して滅菌水で11にしたものを用いた。電気泳
動の緩衝液には1×TBEを用い、電圧2，500V、電流40mA、電力30W、
温度40℃の条件で約30分間予備通電した。ウェルを良く洗い、90℃で
2分間熱処理してから急冷した試料をつんで、約14時間電気泳動をし
た。電気泳動の結果は373Aソフトウェア（ABI社製｝で解析した。
19，32Pを使用した塩基配列の決定
　反応にはSequenaseTM　Ver．2（United　States　Biochemical
Corporation製）を使用した。電気泳動は以下の条件で行った。尿素
20g、40回忌クリルアミド保存溶液5ml、10×TBE　8m1、滅菌水
12・2m1を混合して45－50℃の熱で尿素を溶解し、フィルター濾過後、
10分間脱気してから10％APS　225μ1とTEMED　14μ1を混合してゲ
39
難羅　
灘
町
回．
難
　
懇
翻二二。“ 齢i諮　り
購．
露　s
一一）h．．　一
ル板（40×20×0．5cm）に流し込んで4時間以上静置して5％ポリアク
リルアミドゲルを作製した。緩衝液に2×TBEを用い、1，800Vの電圧
あるいは20mAの電流を上限として約30分間予備通電した。ウェルを良
く洗って、90℃で3分間熱処理後、急冷した反応液をつみ、色素の移
動度を目安にして（Bromophenol　blueが約35塩基、Xylene
cyano1が約130塩基）電気泳動した。泳動後、ゲルを3MM紙
（Whatman二心）にゲルを移し、固定溶液（10％メタノール、10％酢
酸溶液）数mlをかけて約5分間静置後、乾燥機にかけてから、オート
ラジオグラフィーでバンドを検出した。
20．大腸菌によるタンパク質の発現とタンパク質のSDS－PAGE、ウェ
スタンプロッティング
①大腸菌によるタンパク質の発現
　大腸菌発現用プラスミドベクターで形質転換した大腸菌を2×YT
2m1（50μg／m1アンピシリンを含む）に接種し、37℃で一晩振盗培
養した。培養液10μ1を0．1mM　IPTGを含むRich　medium（1％
TryPtone・0・5％Yeast　extract、0，5％塩化ナトリウム）2m1
に接種し、23℃で約5時間振盈培養した。この方法で発現しなかった
場合は培養液200μ1を液体培地2m1に接種し、37℃で3－4時間振
盗培養した。発現を誘導するために最終0．1－10mM　IPTGを培養開始か
ら0－3時間後に混合した。250μ1－500μ1の培養液をマイクロ遠心
40
鍵灘鱗魏灘、。勲・鰻
一L一・rP＿…
チューブに移し・卓上遠心機で8，000rpmで2分間遠心分離した。大腸
菌の沈殿は25μ1のTEに懸濁した。
②タンパク質のSDS－PAGE
　上記大腸菌試料を等量のSDS－PAGE用の2×試料緩衝液｛0．25M
Tris－HCI（pH6．8）、20％グリセロール、4％SDS、10％メルカプト
エタノ・・一・一・・ル、0．04％BPB｝と混合して100℃で3－5分間熱処理した
　（SDS－PAGEに供試するタンパク質の調整法）。2－10μ1を以下の条件
のSDS－PAGEに供試した。サイズマーカーは通常Low　molecular
weight　standard　marker（バイオラッド字面）をTEで8倍に希釈し、
試料と同様に調整して4μ1を供試した。ゲルの作成と泳動はMini
Protean　II（Bio－Rad高庇｝　（ゲル板10×7×0．075cm）あるいは
V－Cell　M（ACI社製）　（ゲル板10×9．5×0．075cm）を使用した。
Separation　ge1溶液｛0．375M　Tris－HC1（pH8．8）、15－8％アク
リルアミド（作成には30％ポリアクリルアミドゲル保存溶液を使
用）、0．1％SDS｝を10分間エヴァポレ…一・‘ターで脱気後、1／100量の
10％APSと1／2，500－1，700量のTEMEDを混合してゲル板の上部が約
し5cm空くように流し込んだ。ゲルの上側表面が平らになるように少
量のSec－Buthanolあるいは滅菌水を重層して1時間以上静置した。ゲ
ル化した後、上側表面を水で洗浄し、濾紙で水を完全に除いた。次に
Stacking　gel溶液｛0．125M　Tris－HC1（pH6．8）、3％アクリルア
ミド（作成には30％ポリアクリルアミドゲル保存溶液を使用）、0．1％
41
騰鑛　騰　　　灘
一一hh．．．．
SDS｝を10分間エヴァボレーターで脱気後、1／100量の10％APSと
1／666量のTEMEDを混合して、空けておいた上部に流し込み、コ＿ム
をさして1時間以上静置した。このようにして作成したゲルの概略を下
に示した。
Stacking　gel
Separation　ge
電気泳動用緩衝液（25mM　Tris、192mMグリシン、0．1％SDS、最終
のpHは8・3）を用い、試料をつんで150V定電圧で電気泳動後、タンパ
ク質を検出するため、クマシー染色あるいは銀染色をした。
③クマシー染色
　クマシー染色液（0．25％Coomassie　Brilliant　Blue　R－250、
45％メタノール、10％酢酸）を浸透させるため、ゲルを溶液中で
0．5－1時間緩やかに振塗した。脱染液（45％メタノール、10％酢酸）
中で振盗して余分なクマシーは除き、タンパク質のバンドを検出した。
④銀染色
　銀染色IIキットワコーを使用した。但し、各操作で1枚あたりの試
薬量は50mlとし、水は滅菌水を用いた。
42
・懇灘灘　灘灘”丁丁
⑤ウェスタンプロッティング
　SDS－PAGEi’lk．　Mini　Trans－Blot　Electrophoretic　Transfer
Ce11（バイオラッド社製）を使用してタンパク質をゲルからPVDFメン
ブレンに転写した。PVDFメンブレンはメタノールに数秒間浸してから
滅菌水中で約10分問緩やかに振乱して親水性にした。PVDFメンブレン
とゲルは転写前に10－15分間、転写緩衝液（25mM　Tris、192mMグリ
シン・20％メタノーール）中で平衡化し、気泡が入らないように下図の
様にセットした。
＋極
クー…一・・kリングユニット
一極
溶液が混合するようにスター・一・tラーで撹搾しながら100V定電圧で1時間
通電した。転写後、PVDFメンブレンをプロ：ッキング溶液【5％スキム
ミルク（雪印乳業）を含むTBS溶液｛50mM　Tris－HCI（pH7．5）、
150mM塩化ナトリウム｝］でブロッキングした（37℃で1時間あるい
は6℃で一晩溶液中に浸しておく）。PVDFメンブレンは室温の0，1％
トリトンX－100を含むTBS溶液中で5分間振堂して余分なスキムミルク
を除いてからビニールバックに入れ、更に、一次抗体を含むプロッキ
43
灘蔑”
一flhh．．．
　　　レ
ング溶液（抗体は用いるものによって異なるが、血清の場合はおよそ
200倍希釈を、また、精製した抗体の場合は5ng／μ1を基準とした）
1－2mlを入れてブロッキング同様にして抗体を反応させた。　TBS溶液
でPVDFメンブレンをかるく洗い、表面の抗体溶液を除いてから、0，1％
トリトンX－100を含むTBS溶液50ml中で10－15分間室温で振盟した
（洗浄操作）．液を入れ換えて同溶液で洗浄操作を2回繰り返した後、
TBS溶液で2回洗浄操作をした。　PVDFメンブレンをビニーールバックに入
れ、酵素結合抗体を含むブロッキング溶液｛酵素結合抗体は最初の抗
体がウサギのものの場合は、HRP－Goat　Anti－Rabbit　IgG（H＋L）あ
るいはAP－Goat　Anti－Rabbit　IgG（H＋L）、マウスのものの場合は、
AP－Rabbit　Anti－M◎use　IgG＋A＋M（H＋L）　（Zymed社製）を1，000倍
希釈で使用した｝1－2mlを入れてブロッキング同様にして抗体を反応
させた。一次抗体と同様に洗浄してから発色を行った。西洋ワサビペ
ルオキシダ・一・一・・ゼ結合抗体｛HRP－Goat　Anti－Rabbit　IgG（H＋L）｝の
場合はKonica　immunostaining　HRD　kit（コスモバイオ社製）を使
用したeアルカリフォスファターゼ結合抗体｛AP－Goat　Anti－
Rabbit　IgG（H＋L）あるいはAP－Rabbit　Anti－Mouse　IgG＋A＋M
（H＋L）｝の場合はPVDFメンブレンを発色用溶液｛0。IM　Tris－HC1
（pH9．5）、0．05M　MgC12、0．1M塩化ナトリウム、0，375mg／ml
Nitro　blue　tetrazolium　chloride　（NBT）　．　O．1875mg／ml　5－
bromo－4－chloro－3－indoly1－phosphate．　4－toluidine　salt；X－
phosphate・4－toluidine　salt（BCIP）｝5mlに浸してバンドを
44
膨縣雛
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綴晒
織
棚糠
諏
　　灘、繊灘　野’
　　　　　　・難慰　総畿懸講
薦
、
一一一nnN一．
D．．．．一A．
解
検出した・どちらとも発色が終わってからPVDFメンブレンを数回水洗
して乾燥させて保存した。
21．アミロースレジンカラムによるMBP融合タンパク質の分離
　目的タンパク質を発現させた状態の大腸菌培養液40m1を準備した。
大腸菌を集菌して（培養液をナルゲン50血1用ナルゲンチューーブに入れ、
6Bローター一・・を使用してSakuma　Model　M－160で6，000rpm、5分間遠心
分離して沈殿させた）菌体の重さを測定した。沈殿lgに対して10皿1の
溶解液【10mM　Na2HPO4、30mM塩化ナトリウム、0．25％Tween　20、
10mMメルカプトエタノーtル、10mM　EDTA、10mM　EGTA
｛Ethyleneglycol　bis　（2－aminoethyl　ether）　tetraacetic
acid｝水酸化ナトリウムでpH7．0に調整したもの］を用いて懸濁し、
直ちに次の操作をするか、一20℃で一晩あるいは一80℃で一度凍結させ
た。10μMPMSF（phenylmethylsulfonyl　fluoride）を加えて、
あるいは加えないまま氷水中にて、30秒間の超音波処理と30秒間の放
置を4－5回繰り返した。0．5M塩化ナトリウムを混合し、　Sakuma
Model　M－160で10，000rpm、4℃で30分間遠心分離して、その上清を
カラムにのせた。カラムは説明書に従ってBed　Volumeで1m1準備した。
0．25％Tween　20を含むカラム緩衝液｛10mM　Na2HPO4、0，5M塩化ナ
トリウム、1mM　NaN3、10mMメルカプトエタノール、1mM　EGTA
（pH7．0）｝をカラムの3倍量通した後、5倍量のカラム緩衝液を通して
45
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購藩
i－A一）一一一”，．．．．．一“．一一一
　　　（i
吸着しない大腸菌タンパク質を流し出した。10mM　Malt。seを含むカ
ラム緩衝液を0・5m1ずつ入れ、その度に溶出液を分取した。最初の2－5
分画をBradford法あるいはOD28。の吸光度を測定して濃度を算出した。
撫
22・大腸菌タンパク質からGST－P10miniの分離
　目的タンパク質を発現した状態の大腸菌培養液40皿1を準備した。
大腸菌を集菌して（培養液をナルゲン50ml用ナルゲンチュ・一一ブに入れ、
6Bローターを使用してSaku皿a　Model　M－160で6，000rpm、5分間遠心
分離して沈殿させた）重さを測定した。10m1／9となるように0．02M
PBS（pH7．4）で沈殿を懸濁した後、直ちに次の操作をするか、一20℃
で一晩あるいは一80℃で一度凍結させた。10　，a　M　PMSF
（phenylmethylsulfonyl　fluoride）を加えて、あるいは加えない
まま氷水中にて、30秒間の超音波処理と30秒間の放置を4－5回繰り返
した。1％トリトンX－IOOを混合し、　Sakuma　Model　M－160で
10，000rp臥4℃で30分間遠心分離して、その上清を試料とした。グ
ルタチオンアガロ：一スビ・・一・一・一ズ（シグマ社製）は20×量（V／W）の
0．02M　PBS（pH7．4）で膨潤させて50％Slurryとした。その500μ1
を用いてカラムを作成した。0．02M　PBS（pH7．4）50m1を通した後、
上記で準備した試料を通して吸着させた。吸着しない大腸菌タンパク
質は0．02M　PBS（pH7．4｝75m1を通して流し出した。5mM還元型グ
ルタチオンを含む50mM　Tris－HC1（pH8，0）を0，5m1ずつ入れ．その
46
轍義　一灘一
Niaih．．．．．．．．一．‘一一
　　　　ド
度に溶出液を分取した．最初の2－5分画をOD28。の吸光度を測定して濃
度を算出した。
藏
難
鑛
23．タンパク質の濃度測定（Bradford法）
　Bio－Rad　Protein　Assay　Kit　Iを使用した。スタンダードのIgG
は0、1．37、6．0、10，0、16．0、20．0、27．4μg／mlとして300μ1量
にDye　reagent（Coomassie　Brilliant　Blue　G－250）73μ1を
混合し、5分間以上室温で反応させた。OD595の吸光値を測定し、　IgG濃
度を横軸、吸光度を縦軸にスタンダー…一・・ドのグラフを作成した。タンパ
ク質試料は同様に反応させて吸光値を測定した。グラフにその吸光度
を対応させて濃度を算：出した。
卜渡
24・GST融合タンパク質でマウスを免疫する方法
　目的タンパク質を発現させた状態の大腸菌培養液40mlを準備した。
大腸菌を集回して（培養液をナルゲン50ml用ナルゲンチ1．・一一ブに入れ、
6Bローターを使用してSakuma　Model　M－160で6，000回忌m、5分問遠心
分離して沈殿させた）菌体の重さを測定した。10m1／gとなるように試
料緩衝液｛100mM塩化ナトリウム、lmM　EDTA（pH8．0）、50mM
Tris－HCI（pH8．0）｝で沈殿を懸濁し、氷水中にて、30秒間の超音
波処理と30秒間の放置を全部で5分間行った。Sakuma　Model　M－160
47
灘曜’ @灘
羅
i－fii一．．．．．，．，，．．．一一一N
で10・000rpm、10分間4℃で遠心分離してタンパク質を沈殿させ、
重量を測定した．10m1／gとなるように試料緩衝液で沈殿を懸濁し、
8mM　MgC12・7units／μ1DNase　I（70units／μ1）、0．1％リゾチー
ム、0．1％Nonidet　P－40を混合して37℃で30分問保温した。　Sakuma
Model　M－160で10，000rpm、10分間4℃で遠心分離してできた沈殿
の重量を測定し、5m1／gとなるようにTEで溶解し、　SDS－PAGE用に試料
調整して30－40μ1／レーンで10％SDS－PAGEに供試した。タンパク質
のSDS－PAGE同様であるが（方法20．）、ゲル板には16×16×0，　lcm用
を用い、マリソル社製スラブゲル電気泳動装置を用いて200V定電圧で
通電した・発現させていない状態の培養液と発現させた状態の培養液
1m1を準備し、そこから集高したタンパク質をTE　50μ1に懸濁して
SDS－PAGE用に試料調整し、20μ1を供試した。サイズマーカーはL。w
molecular　weight　standard皿arker（バイオラッド社製）をTEで
8倍に希釈レ試料と同様に調整して6μ1を供試した。サイズマ三一・一一・一
カー・発現させていないタンパク質、発現させたタンパク質、抗原用
の両端のレーーンの半分を切り取ってクマシーで染色して発現タンパク
質の位置を確認した。抗原用としては6レーン分のゲルを切り出した。
ゲルは乳鉢と乳棒で磨砕して50mM　Tris－HC1（pH7．8）3．6m1に懸
濁した。マウスを免疫するためには腹腔内注射を行った。試料300
μ1を等量の不完全アジバンドと乳化して1回の注射に用いた。2週間
間隔で注射し、2回目の注射から2週間後に部分採血して、その血清を
使用した。
48
　　　コ
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灘
鰻
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一
難
羅
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一i－n）一．v．）．AL
25，抗体の精製
　操作は冷室（6－8℃）で行った。血清が凍結乾燥保存してあった場
合は滅菌水でもと量にもどしてから使用した。2mlの血清を滅菌水で
10mlに希釈し、スター一・・ラーで撹拝しながら液が白濁するまで水飽和硫
酸アンモニウムを徐々に混ぜていった（5－6m1）。白濁が見られてか
ら30分間撹搾し、その後4時間静置した。SAKUMA　Mode190－22で
3，600rpm、20分間遠心分離し、できた沈殿を0．OIM　PBS（pH7，4）
（68．4mM塩化ナトリウム、0．7mM　KH2PO4、4mM　Na2HPO，12H20、
1．34mM塩化カリウム、0．01％Na　N3）lmlに溶解した。この溶液を透
析膜｛沸騰水に3回通したSeamless　cellu1Qse　tubing（VISKASE
SALES　CORP．三光純薬社製）｝に入れて、0，01M　PBS（pH7．4）
500mlで透析した（1時間で新しい液に換え、更に1時間後にも液を換
え、次に一晩透析した）。透析した試料は0．OIM　PBS（pH7。4｝を用
い、陰イオン交換セルロースカラム（DE－322－3g　Whatmann社製）
を通過させて（カラムは説明書に従って洗浄操作したものを用いた）
抗体を分取した。抗体濃度はOD28。の吸光度を測定して算出した。
欝
滋
26．SP6ポリメラーゼによる転写反応
反応液｛40mM　Tris－HC1（pH　7．9）、6mM　MgC12、2mM
49
灘難r 灘灘’ p
f
spermidine一くHCI），．　lmM　DTT．　27．5－55units　RNase
inhibitor、0．5mM　NTP、0．3units／μlSP6ポリメラ・一・・一・・ゼ、0、2
μg／μ1DNA｝を37℃で2時間保温した後、　DNase　I　70unitsを混
合して37℃で20－30分間保温してDNAを除去した。但し、5i末端に
キャップ構造を付加する場合には0．5mM　NTPのかわりに0．5mM　ATP、
CTP、　UTP、0．05mM　GTP、0．5mM　GpppGを用い、　SP6ポリメラーゼ
は0・6units／μ1とした。核酸はフェノール・クロロフォルム抽出し
てからエタノール沈殿して回収した。
灘
離
職
鑛
麟
磯
27．コムギ胚芽抽出液による翻訳反応
　変性したmRNA　L6μ1に小麦胚芽抽出液6，25μ1、1mMアミノ酸
混合液（メチオニンを除く）1μ1、IM酢酸カリウム1．625μ1
（130mMの場合）あるいは、0、625μ1（50mMの場合）あるいは2，5
μ1（50mMの場合）、IOmM　DTT　1，25μ1、　RNase　inhibitor
（40units／μ1）0・25μ1、3Hメチオニン（83．4皿Ci／mmol）　（アマ
シャム社製）1．625μ1を混合して反応液とした。また、15％SDS－
PAGEにはV－Cell　M（ACI社製）　（ゲル板10×9．5×0．075cm）を使用
した。
50
灘
『謹 灘騨鱒・
誘　咀．
一一gi一一．．．．．，．．．．．．．．．L
．
難
　
、
懸
IV．結果と論議
1・S1－S8がコードするタンパク質の解析
　これまでにRRSVのSl－S8の塩基配列は決定されていないが、レオウ
イルス科ウイルスのゲノムの解析から各セグメントには一つの長い
ORFがあると考えられる。一方、　RRSV粒子を構成する7種類のタンパク
質（構造タンパク質）はRRSVの遺伝子から発現すると考えられる．そ
こでSl－S8がコードするタンパク質を同定するために、　S1－S8中のORF
と構造タンパク質の対応を調べることにした。
鞍
懸
結果
①cDNAとセグメントの対応
　Lee　etal・（1987）はRRSVの全セグメント混合状態のmRNAから
cDNAを合成し、　pBR322字置st　1部位に組み込んだので（pRR）　（図
1）・まず、各プラスミドに組み込まれたcDNAがどのセグメントに由
来するのかをコロニーハイブリダイ直轄ションで同定した（方法
9．）。RRSVのゲノムをPAGEで各セグメントに分離し、それぞれを32P
で標識してプローブとした。但し、セグメント1（Sl）とS2、　S3とS4、
　　　　　　　　　　　　　　　51
灘難二二二二 麺　・ ．懇
　　　　Hin　d　III　29
Eco　R　1　4359　／　iEco　R　V　185
　　Dra　1　3941
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Pst　1　3607
RRSVcDNA
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誌．タ　H詣h315562
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　　・〈・｛・1｛ミ鞍／／Sa1　1　651
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　　　4361＋cDNA　bp
　　（pBR322）
　　　　　　　ノ　　Dra　l　3230・／◇＼
Dra　1　3249
　主な6塩基認識の制限酵素中、pBR322に存在しない制限酵素
図lpRRの制限酵素地図
RRSVのmRNAから逆転写反応によって得られたcDNAにポリdC
を付加し、pBR322のPst　I部位にポリdGを付加して挿入した。
そのため、cDNAのライゲ・・一・一・一シヨン部位にはポリdGdC塩基対
　（tail）が存在する。制限酵素の横の数値はpBR322におけ
る位置を示し、Tcはテトラサイクリン耐性遺伝子、　ORIは複
製起点を示す。
52
s　’属　t　　　　認　ny
i－igh．．．．．．．．一．一一
S7とS8はPAGEで近接していたため、混合状態のままプローブとした。
ハイブリダイゼーションの結果、各プローブについてそれぞれ反応し
たクローンがあった（図2）。そこで制限酵素地図作成のために用いた
プローーブごとにcDNAの長いものから2－4個のクローンを選抜した．大
腸菌から各プラスミドを抽出して（方法16．）、6塩基認識の制限酵素
　（宝酒造前回あるいはニッポンジーン社製）を単独あるいは複数を組
み合わせて反応させてからアガロースゲル電気泳動に供試した（方法
17・）・一緒に供試したサイズマーカーから切断で現れたDNA断片の長
さを計測し、制限酵素によるpBR322の制限酵素認識部位と合わせて
cDNA上の制限酵素認識部位を同定した（図3）。コロニーハイブリダ
イゼーションで同じセグメント由来と同定したcDNAは制限酵素地図が
重複していた・その重なり方に従って、プローブが分離できなかった
クロ：一ンをまとめると、SlとS2では3つのグループに、　S3とS4、　S7と
S8では2つのグループに分かれた。そこでこれらのグループとセグメ
ントの対応を明確にするため、ドットプロットハイブリダイゼーショ
ンを行った（方法10．）。各グル・・一…一・プの中でcDNAの長いものを32　Pで標
識してプローブとした。RRSVのゲノムをPAGEに供試してS1とS2、　S3
とS4、　S7とS8をそれぞれ分離し、ゲルから抽出してナイロンメンブレ
ンにスポットした・PAGEでは完全に分離できずに近接したセグメント
どうしが混入することを考慮して、原液の他、原液を5倍と25倍に希
釈してスポットした．　ハイブリダイゼ・・一・一・‘ションの結果、各プローブに
53
潔
i－fii一一一一一q．N－e一一一一一一一一一
（A）プローーブ：S1＋S2
羅
蕪
…
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駕『隔剛D
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37 390 93 398 414 416 420 424 40 42
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図2コロニー一ハイブリダイゼーションによるcDNAクローンの
　　セグメント同定
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55
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図2（続）
56
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（続〉図2
57
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図2（続）
58
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図2（続）
各プラスミドで形質転換した大腸菌をメンブレン上で増殖させ、
その位置でタンパク質を変性させて、プラスミドを含む核酸を
メンブレンに吸着させた。RRSVのゲノムを32Pで標識後、
各セグメントに分離したものをプローブとして用い、ハイブリ
ダイゼーションを行った。X線フィルムで検出した結果を、
用いたプローーブによって（A＞一Φ）に分けて示した。
各写真の下側の図は吸着させたプラスミドのメンブレン上の
位置とハイブリダイゼーションの結果を示す。★は強い反応、
＊は弱い反応を示す。また、同じプラスミドが複数のセグメン
トに反応している場合があり、それらには反応の印を付けてい
ない。
59
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ついてそれぞれ反応があった（図4）。そこで現れた反応の強さから各
プラスミドに対応するセグメントを同定した。これらのcDNAの解析結
果は表1にまとめた。
②Sl－S8がコードするタンパク質の部分的発現
　Sl－S8に由来するcDNAの読み取り枠（ORF）を大腸菌で発現させた。
まず、図5の横向きの矢印で示した部位に相当するcDNAをpUCII9のマ
ルチクローニング部位にサブクローーニングして（方法15，）、両端の
約200塩基の配列を決定した（方法18，）。それぞれのcDNAの塩基配
列において・フレームを1つずつずらして3つのORFを検索したところ、
終止コドンの現れない一方向のフレームが見つかった。ORFの方向は
図5の矢印で示した。ここでcDNAに見つかったORFは各セグメントがコ＿．．一一
ドするORFの一部と考えられる。そこでプラスミドのマルチクロ＿ニ
ング部位とDNAの平滑末端化を利用し、読み取り枠を合わせてcDNA断
片をそれぞれ大腸菌発現用プラスミドベクター一一一　pGEX－3Xあるいは
pMAL－c2にサブクローニングした（方法15．）。pGEX－3Xの場合はグ
ルタチオンーS一トランスフェラーゼ、pMAL－c2の場合はマルトース結
合タンパク質遺伝子の下流側にcDNAが挿入され、大腸菌で融合タンパ
ク質として発現される（図6）。以降、作成したプラスミドの名称を、
“組み換えに用いたプラスミドベクター名の後に組み込んだDNA断片
のもととなったpRRの番号”で示し、それから発現するタンパク質を
62
山山二二．
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　　　　　図4　cDNAクローンのセグメントの同定
RRSVのゲノムをセグメントに分離してメンブレンに吸着させ、
各cDNAクローンを32Pで標識して作成したプローブを用いてハ
イブリダイゼーションを行った。各セグメントをメンブレンに
吸着させる際には原液とその5倍と25倍の希釈液を用いた。プ
ローブ作成に用いたプラスミドとメンブレンに吸着させた各セ
グメントの希釈倍数及び、その位置を図の下側に示した。ハイ
ブリダイゼーションの結果、判定したセグメントを★で示した。
　　　　　　　　　　　　　63
m纒
表1各プラスミドに挿入されたcDNAの性質
クローンNo。 cDNAの大きさ
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　コロニー
nイブリダイ
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表1（続）
クローンNo． cDNAの大きさ
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[ーション
　コロニ・一
nイブリダイ
[ーション
制限酵素地図
繧ﾅの重なり
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表1（続）
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nイブリダイ
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繧ﾅの重なり
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477 llOO 7．8
483 1100 7．8
499 1100 7．8
各ハイブリダイゼーションの結果は反応したセグメントを示し、反応が弱かった
ものに＊を付けた
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（Long）　（Short）
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Sal　1　Xho　1　Xho　1
　　　　　　　　　　　　　Sal　1　Eco　R　V　Eeo　R　I
　　　　　　　　　　　　　　　　　Eco　R　V
　　図5発現用プラスミドベクターに組み込んだcDNAの部位
横向きの矢印の方向は読み取り枠の方向、長さは発現用プラスミドに
組み込んだ部位をを示す。但し、S5の場合はこの制限酵素地図上で向
きを判定できなかった。
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pRRから2種類の発現用プラスミドを作成した場合は挿入したDNA断片
の長い方をLong、短い方をShortとして区別した。　pGEX－3Xの場合は、
pGEX　SEQUENCING　PRIMER（dGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG、ファル
マシア社製）、pMAL－c2の場合は合成したプライマー（dGGTCGTCAGAC
TGTCGATGAAGCC）でcDNAの挿入開始部位の塩基配列を確認した（方
法19．）。融合タンパク質を発現させるために、まず、作成したプラ
スミドそれぞれで大腸菌JM109を形質転換した（方法15．）。IPTGを
培養液に加えて発現を誘導した場合とIPTGを加えないで発現を誘導し
ない場合の大腸菌タンパク質を8％SDS－PAGEに供試して、クマシーで
染色して現れたバンドのパターンを比較した（方法20，）。IPTGによ
る誘導をしなかった場合に対して、誘導をした場合にのみ現れるバン
ドが発現タンパク質と考えられるが、実際には誘導していないにもか
かわらず、融合タンパク質がわずかながら発現している場合があった。
但し、その際には誘導によって発現量が特異的に増加した。大腸菌タ
ンパク質の中には融合タンパク質が発現することでその量が変化する
ものがあったが、それらのタンパク質は種類の違うプラスミドを用い
た場合でも同様に変化し、また、変化量が比較的小さいために目的の
発現タンパク質とは区別できた。pGEX316、　pMAL316、　pGEX137、
pGEX351、　pGEX314、　pGEX414では発現タンパク質が確認できたが、
69
灘二二懸難，
難
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pGEX283（Long）、　pGEX454、　pGEX226（Long）においては大腸菌培
養の条件、発現の誘導を開始する時間などの条件を変えたにもかかわ
らず、発現タンパクが見られなかった。そこで、pGEX283（Long）、
pGEX226（Long）においては挿入するcDNAを新たに変えて発現を試み
た｛pGEX283（Short）、pGEX226（Short）｝。pGEX454に関して
は発現ベクターをpMAL－c2に変え、同じDNA断片を使用した
　（pMAL454）。IPTGで発現を誘導した結果、　pGEX226とpMAL454で．
発現タンパク質が確認できた。発現を誘導した際の大腸菌タンパク質
を8％SDS－PAGEで解析した結果を図7に示した。アが乞田スゲル電気
泳動の移動度からプラスミドに挿入した各DNAの長さを推定したとこ
ろ、それぞれl110（pGEX316、　pMAL316）、570（pGEX137）、780
（pGEX454．　pMAL454）．　440　（pGEX351）．　1280　（pGEX283　Long）．
750　（pGEX283　Short）．　730　（pGEX314）．　1280　（pGEX208）．　400
（pGEX414）、950（pGEX226　Long）、300（pGEX226　Short）塩基で
あった・pGEX－3Xの場合はGSTの27．5KDa、　pMAL－c2の場合はMBPの
42KDaを加えることとし、1アミノ酸を110Daとして発現する予定の分
子量を推定したところ、pGEX316、　pMAL316、　pMAL454、　pGEX314、
pGEX414、　pGEX226（Short）では実際に発現したタンパク質の分子
量と一致した。pGEX137、　pGEX351では推定分子量より発現したタン
パク質の分子量の方が約3　一一　6KDa小さかった。　pGEX454、　pGEX283
（Long）・pGEX283（Short）はクマシーの染色ではなく抗GST抗体を
70
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出を試みたところ、pGEX454は反応が現れず、　pGEX283（L。ng）、
pGEX283（Short）ではほぼ同じ位置（8％SDS－PAGEでほぼ泳動の先
端）に反応が現れた（結果は載せなかった）。pRR454のDNA断片の
ORFはpGEXでは発現できず、　pMALでも発現量が少ないことから、　ORF
のアミノ酸配列が大腸菌による発現には適していないと考えられた。
pGEX283は塩基配列を決定した際、制限酵素地図のPst　IのXba　I側
に通常ではみられないポリdG配列があった。抗GST抗体を用いてウェ
スタンブ1コッティングでpGEX283（Long｝、pGEX283（Short）でほ
ぼ同じ位置（8％SDS－PAGEではほぼ泳動の先端）に反応が現れたこと
から（結果は載せなかった）、ポリdGの塩基数が解析と違っていてフ
レームが合っていないか、ポリdG配列によって融合タンパク質の発現
が阻害されていると予想したe
③発現タンパク質とRRSV純化粒子に対するポリクローナル抗体（抗
RRSV粒子抗体）の反応
　RRSV粒子の7種類の構造タンパク質はRRSVのゲノムにコードされて
いると考えられる。そこで発現させたこれらのタンパク質と抗RRSV粒
子抗体（この抗体は7種類の構造タンパク質全てに反応する）の反応を
ウェスタンブロ：ッティング法で調べた（方法20，）。発現タンパク質と
は関係ないが・大腸菌タンパク質の中にはRRSV粒子に対するポリクロ＿
72
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ナル抗体と反応するタンパク質があったので発現を誘導した大腸菌タ
ンパク質と発現を誘導しなかった大腸菌タンパク質で比較した。タン
パク質（クマシー染色で確認できる1／10量）は8％SDS－PAGE後、
PVDFメンブレンに転写した。一次抗体には河野氏が純化RRSV粒子でウ
サギを免疫した血清で、凍結乾燥して6－10℃で保存してあったものを
用いた。但し、血清は精製し（方法25．）、波長280nmの吸光度から濃
度を算出して70μ9／m1にして使用した。二次抗体はアルカリフォスファ
ターゼ結合抗体を使用した。NBTとBCIPでアルカリフォスファターゼ
を検出したところ、S1由来のMBP454、　S2由来のGST137、　GST316、
MBP316、　S3由来のGST351、　S6由来のGST208、　S8由来のGST414に反
応があった（図8）。
④RRSVの構造タンパク質と発現タンパク質に対するポリクローナル
抗体の反応
　抗体を作成するために、大腸菌タンパク質から発現タンパク質を分
離した。MBP316とMBP454は発現を誘導した培養液40mlからアミロ・一一
スレジンカラムによって分離した（方法21．）。Bradford法によって
濃度を測定したところ（方法23．）、MBP316は約300μ　g、　MBP454は
135μgであった。MBP316は約50μgをIOmM　Tris－HCI（pH8．0）、
100mM塩化ナトリウム溶液として3日問間隔で5回ウサギの耳に静脈注
射し、最後の注射の3日後に耳から採血した。MBP454は約10μgを等
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の腹腔内に注射し、2回目の注射から2週間後に採血した。GST137、
GST316、　GST351、　GST314、　GST208、　GST414、　GST226｝ま10％　SDS－
PAGEによって分離してマウスの腹腔内に注射して免疫した（方法
24・）・RRSVの構造タンパク質はRRSV粒子を純化して得た（方法
2）。作成したこれらの抗体（100倍希釈で使用）とRRSVの構造タンパ
ク質（1・4μ9／レ・一・一・・ン）の反応をウェスタンプロッティング法で調べ
た（方法20．）。但し、大腸菌で発現したタンパク質が非構造タンパ
ク質の一一部である場合を考慮して、RRSV罹病イネもSDS－PAGEに供試
しておいた。RRSV罹病イネは腫瘍部位を4倍量（V／W）の0，02M　PBS－
Tween中で磨砕し、　SDS－PAGE用に調整して10μ1を用いた。また、抗
体ができていることを確認するためにタンパク質の発現を誘導した大
腸菌を用いた（銀染色で確認できる量）。それらの結果は表2にまとめ
た。RRSV罹病イネの場合、ウェスタンプロッティングでは反応が全く
なかったり、反応しても非特異的反応との区別が難しく判定はできな
かった。抗RRSV粒子抗体と反応した発現タンパク質に対する抗体は
RRSVの構造タンパク質のどれかに反応すると予想された。作成した抗
体全てが反応したわけではなかったが、S6由来のGST208に対する抗体
とS8由来のGST414発現タンパク質に対する抗体は構造タンパク質と反
応した（表2）。反応した位置からGST208の場合、　Chen　eta1．
（1989b）の88KDaの主要ではない構造タンパク質に相当すると考え
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質両方に反応した（図9C、　D）。
論議
　レオウイルス科ウイルスではゲノムが分節しており、その遺伝子構
造の解明にはセグメントごとの解析が必要である。そこで本研究では
ハイブリダイ他門ションによって遺伝子ライブラリーの中からセグメ
ントごとに・2－4個のcDNAクローンを選抜した（図2）。これらの
cDNAの制限酵素地図には部分的な重なりがあることから、同一領域に
対するcDNAクローンと考えられる（図3）。ウイルスゲノムの塩基配
列の解析でしばしば変異が見つかるので、同一領域の2つ以上のcDNA
を解析する必要がある・また、デリーションやサブクローニングには
作成した制限酵素地図が利用できる。但し、図3には確実に存在する制
限酵素認識部位だけを示しているので、同じ制限酵素認識配列が近接
していたり、メチレーションで酵素が配列を認識できなくなっている
場合までは分からない．RRSVの各セグメントの塩基数は電子顕微鏡観
察で推定されている（Uyeda　eta1．，1990b）。cDNAの重複領域を考
慮すると・各セグメントそれぞれの約48％（S1）、100％（S2）、80％
（S3）　．　86％　（S4）　．　84％　（S5）　，　60％　（S6）　．　IOOY，　（S7）　．　90％
（S8）が選抜したクローンに含まれると推定された。但し、この推定
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らの結果から・遺伝子構造を解明するために有用なクローンが選抜で
きた。
　これらのcDNAを利用してS1－S8のORFの一部を大腸菌で発現させた。
cDNAの両端の塩基配列には一方向のORFが見出された。　S4のcDNA
｛pGEX283（Short）と（Long）｝は発現せず、また、　pGEX137と
pGEX351では3－6KDa程小さかったが、ほぼ推定した分子量のタンパク
質が発現した・これらのことから、各セグメントに長いORFがあると
いう推定が正しいと考えられる。RDV（S11を除く各セグメントで80－
98％）・WTV（S4－S11で83－92％）のセグメントと同様に（Suzuki，
1995；Nuss　and　Da11，1990）、RRSVのS9では90％に、　S10では小
さいものと主要なものをあわせて80％にORFが存在していた（Yan　e亡
a1・・1995）・そこでRRSVの各セグメントの推定塩基数をもとに
（Uyeda　e亡a1．，1990b）、その約90％にORFが存在すると仮定して、
そこにコードされるタンパク質の分子量を推定したeRRSVの構造タン
パク質はRRSVのセグメントから発現する産物と考えられる。そこで推
定した分子量と構造タンパク質の分子量と比較した（表3）。ここでは
7種類の構造タンパク質の分子量を載せたが、本研究ではそれら以外の
バンドも現れた（図9A中の白抜きの矢印で示した）　（Hagiwara　et
al．　，1990；Chen　et　a1、，1989b）。それはChen（1985）とChen
eta1．（1989b）の電気泳動像にも同様に現れていることから、別の
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はRRSVの構造タンパク質と反応しなかったが、抗RRSV粒子抗体はこれ
らの発現タンパク質に反応した。表4にはRDV、　rotavirus（SA11
株）・reovirus（Dearing株）について各セグメントの塩基数とそれ
がコードしているタンパク質を示した。この表から約3，000bpより長
いセグメントが必ず構造タンパク質をコードすることが分かる。従っ
て・RRSVの場合もS1、　S2、　S3が構造タンパク質をコードしている可
能性が高いと考えられる（図8）。大腸菌によって発現したGSTの融合
タンパク質はほとんど不溶化したため、cDNAから発現した部分のタン
パク質をFactorXaによって切り離せなかった。そのため、抗体は抗原
として用いたGST一融合タンパク質に反応することで作成されたことを
確認したが（表2）、cDNAから発現したタンパク質部分に反応するこ
とは確認できなかった．S1、　S2、　S3由来の発現タンパク質に対する抗
体はRRSVの構造タンパク質と反応しなかった理由として、作成された
抗体の検出限界が低いことや特異的結合力が低いことが考えられる。
一方、S6由来のGST208に対する抗体はウェスタンブロティングで構造
タンパク質と反応した（図9B）。反応したバンドの位置からChen　et
a1．（1989b）の88KDaの主要ではない構造タンパク質に相当すると考
えられた。表3の推定ではS6は約77KDaのタンパク質をコードする。こ
の約10KDaの違いは推定の誤差、あるいはタンパク質の修飾のためと
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考えられる。Oryza　virus属にはRRSVの他にERSVがある。　ERSVと
RRSVでは媒介昆虫の種類が異なる。また、　RRSVの粒子には外殻がない
と考えられているのに対し、ERSV粒子はFi／ivirus属と同様に2重殻で
ある（Chen　eta1．，1989a）。しかし、ヒエにおける病徴、ゲノム
と量比を含めた構造タンパク質のPAGEによる分離パターンはRRSVと類
似している（Chen　e亡al・，1989b）　（図10）。そこでERSVに関して
もRRSV同様に各セグメントにコードされるタンパク質の分子量を推定
し・その構造タンパク質の分子量と比較した（表5）．但し、塩基数は
RRSVとERSVの各セグメントの分子量（Chen　e亡a1．，1989b）とRRSV
の推定塩基数（Uyeda　e亡a1．，1990b＞をもとにして推定した。　RRSV
のS6はERSVのS6より約300塩基短くなっており、それらが同じ分子量
のタンパク質をコ・・一・一・ドしている可能性は低い（表3、表5）．構造タン
パク質を比較すると、ERSVにはRRSVの88KDaに相当する構造タンパク
質がない（図10）・ERSVとRRSVではゲノムと構造タンパク質の分離
パターンが良く似ているが、S6と88KDaの構造タンパク質の両方に違
いがある・このことはRRSVのS6が88KDaの構造タンパク質をコードし
ているという本研究の結果と一致している。
　S8由来のGST414に対する抗体は50KDaと63KDaの主要な構造タンパ
ク質に反応した（図9D）。また、　RRSVのS8は約65KDaのタンパク質
をコードすると推定されることから（表3）、S8が63KDaの主要な構造
タンパク質をコードしていると考えられる。RRSVのS8とERSVのS8の
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図10　ERSVとRRSVのゲノムと構造タンパク質の電
　　　気泳動像の模式図
Chen　eta1．（1989b）の結果を模式化したものである。
（A）各ゲノムを同一の10％PAGEで分離した結果を示す。
（B）各純化粒子を7．5－15％Gradient　PAGEによって分
　　離した結果を示す。構造タンパク質の太線は主要な
　　もの、細線は主要でないものを示す。
85
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ンパク質をコードしている可能性は高いと考えられる（表3、表5）。
構造タンパク質を比較すると、ERSVとRRSVの両方に63KDaの主要な構
造タンパク質がある・このことはRRSVのS8は63KDaの構造タンパク質
をコードしているという本研究の結果と一致する。一方、50KDaのタ
ンパク質は表3の計算をもとにして逆算すると、1515塩基のセグメン
トがこれをコ一一・・ドすることになる。RRSVにはこれに相当するセグメン
トはない・このことはRRSVのS8は63KDaだけでなく50KDaもコードし
ているという本研究の結果と一致している。50KDaの構造タンパク質
はERSVにも存在するが、主要なものではない。　RRSVとERSVの主要な
構造タンパク質のうち、唯一50KDaの構造タンパク質に違いが認めら
れることからERSVとRRSVの粒子構造の違いにこのタンパク質が関与し
ていることが推察される。ERSVとRRSVでは同様にS8が63KDaの構造タ
ンパク質をコードしていると予想されるが、50KDaの構造タンパク質
には違いがある。RRSVのS8は50KDaの構造タンパク質をコードしてい
ると考えられるのでERSVのS8との違いに興味が持たれる。　GST414に
対する抗体が63KDaと50KDaの構造タンパク質に反応したことはこれ
らの構造タンパク質が共通のアミノ酸配列を含むことを示している。
レオウイルス（Dearing株）の主な外殻タンパク質であるμ1
（76．3KDa）は粒子を構成する際にN末端側の42アミノ酸（4，2KDa）
が除かれてμlCとなる（Jayasuriya　e亡a1．、1988）。63KDaの構造
87
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mRNAの合成、翻訳の過程で50KDaのタンパク質が発現すると予想され
る。
2．S9の解析
懇
　RRSVのS9では通常のS9（SgU）に混ざって電気泳動の移動度が早い
もの（SgL）が検出された（Yan，1992）。SgUを持つRRSV（SgU
RRSV）とSgLを持つRRSV（SgL　RRSV）が混合感染したイネを獲得源
とした伝搬実験では、伝搬後のイネにSgU　RRSVしか検出されていない
（Yan，1992）。また、　SgLを持つRRSV－PはIRRIで継代されているが、
伝搬性が低いとされている。RRSVのS9はSgUを用いて全塩基配列が決
定され（Yan，1992）、片方の鎖に一つのORFが見出されているが、
コードされているタンパク質の検出は試みられていない。そこでまず、
SgUとSgLの塩基配列の違いを明らかにし、　SgL　RRSVの伝搬性を調べ
ることにした。更に、S9がコードするタンパク質（P9）を同定するた
めに、構造タンパク質との関係を調べることにした。
結果
①PAGEによるS9の変異の検出
88
　フィリピンで継代している株（RRSV－P）のS9はSgLであったことか
ら（Yan，1992）、本研究ではタイで継代している株（RRSV－T）　（上
田氏提供）のS9の移動度を調べた。北海道大学で継代している株
（RRSV－H）のゲノムと共にRRSV－PとRRSV－Tのゲノムを10％SDS．
PAGEに供試した（方法6．）。電気泳動後、ゲルの銀染色をして（方法
8・）・分離した各セグメントを比較したところ、RRSV－TのS9はSgLで
あった（図11）。RRSV－Hの場合、罹病イネの株ごとにゲノムを抽出し
て調べたところ（方法4・）、ほとんどの株のS9はSgUであったが、中
にはYan　e亡aL（1992）同様、　SgUとSgL両方が検出される株があっ
た（図11、レ・一…一・liン5）。
漿
螺
②SgLとSgUの塩基配列の比較
　RRSVのS9はRRSV－HのSgUを材料にして塩基配列が決定された
（Yan，1992）（図12）。SgLはSgUと同じ末端塩基配列を持つことか
ら内部に変異を持つS9と考えられる（Yan　eta1．，1992）。そこで
SgLの塩基配列を調べるため、　RRSV－HのSgUとSgLの混合状態のゲノム
とRRSV－Pのゲノムを用い、5’と3’のそれぞれの末端塩基配列にPst　1
の認識配列を組み込んだプライマ・一・一・を使用して逆転写反応とPCRによっ
てS9の全長DNAを増幅した。増幅したDNAはPst　Iを反応させ、
pUC119のPst　1部位に挿入して（上田氏）、塩基配列を決定した（方
法18．と19．）。決定には市販のM13　Sequencing　Primer（一40）と
89
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　　　　　　図11　RRSVのゲノムの電気泳動による比較
1：北海道大学で継代している株（RRSV－H＞の純化粒子から抽出
　　したゲノム
2と5：RRSV－Hの各感染イネからそれぞれ個別に抽出したゲノム
3：フィリピンで継代している株（RRSV－P）のゲノム
4：タイで継代している株（RRSV－T）のゲノム
　RRSVのゲノムを10％SDS－PAGEで各セグメント（S1－SlO）に分離し、
　銀染色をした。矢印で示したように、移動度の違いからS9をSgU
　　（上側）とSgL（下側）に区別した。
90
灘＿灘灘譲騨　
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CCC　AGC　TCA　GGG　AAG　CGA　GCA　ATG　CAA　CCA　GCC　GTC　AGT　AAA　CCA
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　A　L　L　E　T　V　F　T　L　D　1　W　Y　R　R
ACG　AAC　AAC　CAG　AAC　ATC　GGC　AAT　TTA　AGA　GAT　TCG　GTA　TCT　CGA
　T　N　N　Q　N　1　G　N　L　R　D　S　V　S　R
TTT　CTA　TCT　GAT　GAT　CGA　GTA　AGA　GAA　GCG　GTG　ATG　GTG　CGA　CTA
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　D　L　D　1　V　V　Q　L　K　E　Y　W　L　1　V
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TCG　CAT　CTA　TTT　GTC　AAT　CGC　GGC　GAA　AAC　GCG　AAT　TAT　GAT　CTT
GTA　ACT　CAG　ACG　TTC　ATT　CCG　AGT　GAT　GCT　TTT　CTT　AAG　GAT　AAC
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TTT　AAG　ACG　GAA　GCA　CTT　AAG　AAG　TTG　TTG　CTA　AGT　GTC　CAA　AAC
CAT　　　　ACG　GGA　CTA　GAC　GCT　GGA　TTG　CAA　GGT　GAT　AGT　TCG　AAA　GCG
ACT　TAC　AAC　ATT　GGC　CTA　GGA　CAA　TAT　CTC　GAG　GAT　GAG　GCC　CTC
　T　Y　N　1　G　L　G　Q　Y　L　E　D　E　A　L
CTG　TAC　CGT　CAA　GGT　GTG　GCT　CTA　CAA　CAA　ATG　GCT　TTT　GCG　GAG
TTG　GAA　TTA　GCT　AGA　GGA　GCA　GAG　AAA　GAG　GCG　TTT　CCA　TCA　ACC
TTC　GAT　CTA　AGC　AAT　AGA　CCG　GCT　TGC　AAC　TTG　ATC　CTT　AAG　CGA
　F　D　L　S　N　R　P　A　C　N　L　1　L　K　R
ACG　TGT　AAG　TGG　TAT　CAA　CAA　ACG　TTT　AAG　GAT　GAG　GAG　AGA　AAG
　T　C　K　W　Y　Q　Q　T　F　K　D　E　E　R　K
GAA　TTT　GCG　AAG　AGT　TTG　TGG　GTG　GAT　GAC　TTT　GCC　GAG　GCT　AAT
T．GG　AAC　ACA　GGT　AAT　TTG　TCT　TTT　GGC　TTT　TCA　ACC　ACA　TTA　AAT
GTA　ATT　GAG　AGA　TGG　CGT　TTG　ACC　AGA　TTT　TAT　GTT　CAT　ATG　TAC
　V　1　E　R　W　R　L　T　R　F　Y　V　H　M　Y
TCA　TCT　GTG　CAT　ATA　TAT　TCT　CAG　AA，G　GCC　TCG　GGG　TA，G　GAA
　S　S　V　H　1　Y　S　Q　K　A　S　G　＊ACGCTGGGGATCAAGGTGAATTGAAATGAGGACTTCTCACCCTCATGGACATTC
GGCCTCTTCACGGGTGGCACCCCGAAAACGGCGAGACCATGGTGC
図12RRSVのS9に対するcDNAの塩基配列と主要な読み取り枠のアミノ酸配列
91
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M13　Reverse　Sequenceing　Primerの他、李（1988）の塩基配列を
もとにして合成したプライマー（301－317番目の＋鎖のものと812－828
番目の一鎖のもの）を使用した。各ゲノム材料につき最低3クローンの
塩基配列を調べた結果を図13にまとめた。RRSV－PのSgLには335番目
のグアニンからアデニンへの置換と843番目のアデニンからシトシン
への置換があった。RRSV－HのSgUとSgLの混合状態のゲノム試料のク
ロ：・一・・…ンにはRRSV－Pの843番目のアデニンからシトシンへの置換を持つ
ものがあった。843番目の置換が共通に見つかったことからこの置換
によってPAGE上の移動度の違いが起こったと推測した。
③843番目の塩基置換によるS9のPAGE上の移動度の変化
　843番目の置換がPAGEにおけるS9の移動度を変えることを証明する
ために、843番目がアデニンーウラシル塩基対（A：U）のS9とシトシンー
グアニン塩基対（C：G）のS9を作成することにした。　RNAの合成には
pUCl19のEco　R　I部位にSP6ポリメラーゼのプロモーター配列を挿入
して作られたプラスミドベクター一　pSP6（村尾氏提供）を用いた。組み
込んだプロモーター一・一・・の下流の転写開始部位に平滑末端をもつDNAを挿
入できるようにStuIの認識配列をあらかじめ入れておいた。塩基配列
の決定に用いたクローンの一つからPs亡1でS9の全長DNAを切り出し、
平滑末端化してpSP6のStu　I部位に正方向と逆方向にサブクロ：一三ン
グした（方法15．）．但し、3’末端側のPst　1認識配列は再度クロー二
92
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
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93
ングの過程を経て構成し直した。塩基配列の決定に用いたクローンの
中にはXhoI－Stu　Iの領域（659－1022番目）において843番目だけ
がA：UとC：Gで異なるものがあったので、それらの領域を制限酵素で切
り出し、それぞれ正方向と逆方向に挿入したS9のXhoI－Stu　Iの領域
と入れ換えて843番目だけが異なるプラスミドを作成した（方法
15．）。S9を正方向と逆方向に挿入したそれぞれのプラスミド1μg
を鋳型とし（転写反応前にPstIで切断したもの）、全体の反応液50
μ1としてSP6ポリメラーゼで＋鎖と一鎖を合成した（方法26，）。反
応液の1／10量をL5％アガロ：一スゲル電気泳動に供試して合成した
RNAを確認後（方法17．）、2本鎖にするため、＋鎖と一鎖をアニ・一リ
ング用溶液　｛0．3M塩化ナトリウム、10mM　Tris－HCI（pH7．5）、
lmM　EDTA、2％SDS溶液｝に入れ、74℃で12時間保温した。その後、
核酸は0．28M塩化ナトリウム、4．5mM　ZnSO，、50mM酢酸ナトリウム、
lunit／μlSlヌクレアーゼ反応液中で45℃で1時間保温して突出し
ているプラスミド由来の余分な配列を除いた。1．5％アガロースゲル
電気泳動の確認の際と同量を10％SDS－PAGEに供試した（方法6．）
（図14）。対照としてRRSV－Hのゲノム（SgU＞1μgをSDS－PAGEに供
試して比較したところ、843番目がA：UのS9の移動度はRRSVのゲノム
のSgUと同じであったが、　C：GのS9はそれらに比べて移動度が早かった。
また、同様に合成したRRSV－PのS9（843番目がC：G、335番目がA：U）
の移動度はやはり早かった。
94
1 2 3 4
S5　一一　．
S7S6　二＝
　S8　b　’一
Sg
SlO　’　　一
図14一塩基対の置換によって電気泳動の移動度が変化したS9
　1：RRSVのゲノム
2：843番目がアデニンーウラシル塩基対のS9
3：843番目がシトシンーグアニン塩基対のS9
4：843番目がシトシンーグアニン塩基対で更に335番目を
　　通常のシトシンーグアニン塩基対からアデニン・一・一・・ウラシル
　　　塩基対に変えたS9
試験：管内で作成した各塩基対置換を持つS9をRRSVのゲノムと共に
10％SDS－PAGEに供試し、銀染色をした。
95
野
雛
羅
験・ttt　t
④SgUとSgLの簡易検定法の確立
　SgU　RRSVとSgL　RRSVの混合感染イネを獲得源とした場合のSgL
RRSVの伝搬様式を調べるために、各媒介昆虫が保毒するRRSVのS9の
種類を明らかにすることにした。RRSVは媒介昆虫体内でも増殖するた
め、解析に必要な量のゲノムが得られると考えた。罹病イネから直接
RRSVのゲノムを抽出する方法（方法4．）の試薬量をトビイロウンカー
頭にあわせて、保毒したトビイロ：ウンカからRRSVのゲノムを抽出した。
この試料を10％SDS－PAGEに供試したところ、　RRSVの他、潜在ウイル
ス（Nilaparvata　lugens　reovirUS）のゲノムが現れてしまい、ま
た、一頭から抽出できるゲノムの量が比較的少ないことから、この方
法での解析は難しいことが分かった（結果は載せなかった）。そこで
PCRを利用する検定法を確立することにした。まず、塩基配列の決定
に使用したSgUとSgLのプラスミドを抽出して（方法16，）、その
1／100量を鋳型にして全量100μ1系でPCRを行った（方法14．）．増幅
したS9の全長DNAをフェノー一・・ル・クロ：ロフォルムで抽出してエタノー
ル沈殿後、10％SDS－PAGEに供試したところ、ゲノムで見られた様な
違いは確認できなかった（結果は載せなかった）。そこで、SgUとSgL
は843番目の塩基の違いによることを利用する一本鎖多型分析
（SSCP）を試みた．　SSCPではわずかな塩基の違いが一本鎖核酸の高次
構造に影響してPAGE上の移動度を変えることを利用する。　SSCPは通常、
数百塩基の核酸を対象にしているので、S9の全長の制限酵素認識部位
96
を検索し、843番目を含む約200bpの断片をつくるHap　II（785－788
番目）とNde　I（983－988番目）を見出した。そこで上記のS9の全長
DNAの1／2量にHap　IIとNde　Iを全量100μ1系で反応させた。反応液
の1／5量をエタノール沈殿しs変性溶液（0，3M　NaOH、1mM　EDTA）10
μ1に溶解して5％グリセロールを含む6％PAGEに供試した（方法
7．）．またs対照として滅菌水で溶解した試料、pUCl19をHin　f　Iで
処理した試料も同時に供試した。電気泳動後、ゲルの銀染色をしたと
ころ（方法8．）、複数のバンドが現れた。S9の全長DNAはHap　II
（785－788番目）とNde　Iで3つのDNA断片になるので、目的の断片は
同定できなかったが、変性処理をした場合にSgUとSgLの試料で明らか
に移動度の異なるバンドがあった（図15）。以上の結果からSSCP解析
でSgUとSgLが識別できることが分かった。
鱒
懇　
脇
⑤トビイロウンカ各個体が保毒したRRSVのS9の検定
　罹病イネからRRSVのゲノムを抽出して（方法4．）、10％SDS－PAGE
に供試し、銀染色でSgUとSgLを検定した（方法8，）。SgUとSgLの両
方が検出される罹病イネで若齢のトビイロウンカを4日間獲得野牛させ、
潜伏期間として健全イネで10日間育成後、イネの幼苗で個体別に2日
間接種吸汁させた。また、対照としてSgUだけが検出される罹病イネ
を獲得源として用いた。接種後、トビイロウンカは冷凍保存し、接種
イネは温室で育成した。獲得吸汁した全てのトビイロウンカがRRSVを
97
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鑛灘麟灘灘灘鑛…・，
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図15843番目の塩基対を含む制限酵素切断片の一本鎖多型分析
1：マーカー（pUCI19をHin　f　Iで切断したもの）
2：レーン1の試料を泳動前に変性処理をしたもの
3：843番目にアデニンーチミン塩基対を持つS9の全長dsDNAを
　　．Nde　IとHap　IIで切断したもの
4：レー一・・ン3の試料を泳動前に変性処理したもの
5：843番目にシトシンーグアニン塩基対を持つS9の全長dsDNAを
　　Nde　IとHap　IIで切断し、泳動前に変性処理したもの
6：レーン5の試料で変性処理をしなかったもの
843番目の塩基対が異なるS9の全長DNAをPCRで増幅し、843番目
を含む約200bpの断片を作るためにNde　IとHap　IIで切断した。
試料は泳動前にアルカリで変性したものとしないものを用い、
5％グリセロールを含む6％ポリアクリルアミドゲルで室温で泳動後、
銀染色をした。
98
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保毒するわけではないので（通常では約30％）、ELISA（方法3，）で
劇毒を確認したトビイロウンカからRRSVのゲノムを抽出した（方法
5．）。上記のS9の843番目を含む約200bpの断片はPCRで増幅すること
にし、そのためのプライマー（786－805番目の＋鎖と967－986番目の
一鎖）を合成した。逆転写反応には967－986番目の一鎖を使用した。
これらのプライマーで増幅する領域の＋鎖の二次構造をDNASIS－Mac
v2．0で予測したところ、843番目の塩基の違いだけで構造上の違いが
見られた（図16）．トビイロウンカから抽出したRRSVのゲノムの1／4
量をDMSO変性して（方法12．）から逆転写反応し（方法13．）、その
1／20量を全量50μ1の系のPCRの鋳型とした（方法14．）。また、対照
としてS9の全長DNAを挿入したプラスミドを大腸菌から抽出して（方
法16・）PCRの鋳型として用いた。反応液の1／10量を1，5％アが志下
スゲル電気泳動に供試したところ（方法17．）、約200bpの増幅産物が
確認できた（図17A）。この増幅産物がRRSVのS9由来であることを
確かめるために、アガロースゲルからナイロンメンブレンへ核酸を転
写して、サザンプロットハイブリダイゼー・一・・ションを行った（方法
ll．）。プローブは上記のPCRで増幅したS9の全長DNA約20ngを32　P
で標識して用いた。ハイブリダイゼーション結果、増幅産物の位置に
反応が現れた（図17B）。次に残りのPCR溶液のミネラルオイルをク
ロロフォルム抽出（反応液に等量のクロロフォルムを加え、2－3分間
混合後、卓上遠心機を使用して、12，000rpmで2－3分間遠心分離した
99
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図16一本鎖の二次構造の比較
PCRで増幅した領域（786－986番目）の＋鎖の二次構造を
DNASIS－Mac　v2、0で予測した。843番目がアデニンのも
のをSgUとし、シトシンのものをSgLとした。実際に増幅
したのはDNAであるが、ここに示したのはRNAの解析結果である。
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　　膨　　・・調■図D●●國■■圃）■
図17RRSVの保毒トビイロウンカからS9の一部を逆転写一PCRで増幅した産物
　　　　1：サイズマーカ・・一・…一（pUCI19をHin　f　Iで切断したもの）
　　　　2：S9のDNAを挿入したプラスミドを鋳型として用いたもの
　　　　3－12：保毒トビイロウンカ各個体
　　　　13：保毒させなかったトビイロウンカ
　　　　14：プラスミドから制限酵素で切り出したS9の全長DNA
　（A）：各保毒トビイロウンカごとに抽出した核酸を鋳型とし、S9の843番
　　　目を含む約200bpが増幅するように設定したプライマーを用いて逆
　　　転写反応とPCRを行った。増幅産物はL5％アガロ：一スゲルで電気
　　　泳動し、EtBrで染色した。
　（B）：（A）と同様に泳動後、DNAをナイロ：ンメンブレンに移し、32Pで標識
　　　したS9のDNAプロ　一一ブを用いてハイブリダイゼ酷刑ションを行った。
　　　結合したプローブはX線フィルムで検出した。
101
’1　“」’・籍 ．醗鑛・灘懸二二1欝as、・羅一．．灘
上層を別のマイクロ遠心チューブへとる操作）で除き、核酸をエタノー
ル沈殿して20μ1の滅菌水に溶解した。その4μ1に変性のため1μ1の
DMSO（N2ガスを数十秒間DMSO液に通したもの）を加え、更に、10×
TE｛100mM　Tris－HCI（pH8．0）、10mM　EDTA｝0．9μ1と6×泳動
用色素1・5μ1を混合して5％グリセロールを含む6％PAGEに供試
した（方法7，）。泳動後、ゲルの銀染色をしてバンドを検出した（方
法8．）　（図18）。843番目がA：UのプラスミドとC：Gのプラスミドを大
腸菌から抽出して鋳型とし、同様のPCRで目的の200bpのDNAを増幅し、
SgU型とSgL型のマーカーとした。各マーカーには4本のバンドが見ら
れたが、そのうち2本はSgU型とSgL型のマーカーで移動度が異なって
いた．これを基準にSgUとSgLを判定した結果、　SgUのみ、あるいは
SgLのみ、あるいはそれら両方が検出されるトビイロウンカ個体があっ
た。一方、対照として用いたSgU　RRSV罹病イネの場合はSgUしか検出
されなかった。
⑥SgUとSgLの両方が検出される罹病イネから伝搬したRRSV
　SgU　RRSVとSgL　RRSVが一つのイネ株に混合感染したものを獲得源
とした場合、最初の伝搬実験では、伝搬後のイネにSgU　RRSVしか検出
できなかった（Yan，1992）。しかし、以上実験では混合感染イネを
獲得源とした場合、SgL　RRSVのみを保毒しているトビイロ：ウンカが検
出されたので、これらのトビイロウンカ（解析したトビイロ：ウンカと
102
灘　　鑛灘灘灘
　　難雛購躍’．
）、、、一，灘l11，　ゴ鱗灘1、．卿
　　　　　　ぐ〒’　　　　一｝r鯛輌明慶　ql噂一　　　u
　
　
　
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霧、
引■■■D　噛■丁霊　軸ゆ　　　　螢＿＿◎　　　雇縄9一●㌔圏■闘●●脳　　　一　　　・網剛レ
図18PCRによる増幅産物の一本鎖多型分析
1：SgU型マーカー（843番目にアデニンv一・’…チミン塩基対を持つS9のcDNA
　　を挿入したプラスミドからPCRで増幅した産物）
2と3：SgUだけが検出される罹病イネを用いて保毒させたトビイロ
　　　　ウンカ各個体
4－9：SgUとSgLの両方が検出される罹病イネを用いて保毒させた
　　　　　トビイロウンカ各個体
10：SgL型マーカー一（843番にシトシンー一・・bグアニン塩基対を持つSg　cDNA
　　を挿入したプラスミドからPCRで増幅した産物）
各保毒トビイロウンカごとに抽出した核酸を鋳型とし、逆転写反応
とPCRでS9の843番目を含む約200bpを増幅した。増幅産物をアルカ
リ変性後、5％グリセロールを含む6％ポリアクリルアミドゲルで室
温で電気泳動し、銀染色をした。SgUとSgLで移動度の異なるバンド
を矢印で示した。
lO3
職
灘懸
購纒灘
鞭
纏
嚇
懸
羅灘鐡
．
　
懇欝
搬
灘灘灘羅灘灘　　薦tW
は異なるが、獲得から接種まで同じ群）でRRSVを接種し、発病したイ
ネからRRSVのゲノムを抽出して（方法4．）10％SDS－PAGEで解析した
（図19）．その結果、SgU　RRSVのみ、あるいはSgL　RRSVのみ、ある
いはそれら両方が検出されるイネ個体が見つかった。そこで、SgL
RRSVのみが検出されたイネから直接RRSVのゲノムを抽出し、上記同様
にS9をクローーニングして塩基配列を決定したところ、843番目の塩基
はやはりC：Gであった（図13）。
⑦S9がコ・…一一・Lドするタンパク質（P9）の大腸菌による発現
　S9がコードするP9を解析するために大腸菌による発現を行った。ま
ず、RRSVのゲノムを鋳型に逆転写反応によってS9の全長のcDNAを作
成した（上田氏提供）。　濃度が分からなかったので10μ1をPCRの鋳型
とし（方法14．）、ORFの始まりの塩基配列のプライマー（13－30番目
にEco　R　Iの認識配列を加えたdGGGAATTCATGAAGACTGCCTTTGC）と
＋鎖の3’末端に相補の配列のプライマー（1116－1132番目にPstIの
認識配列を加えたdGGGCTGCAGCACCATGGTCTCGCCG）を用いて全量50
μ1系のPCRを行った（方法14，）。反応後、1／10量を1％アガロース
ゲル電気泳動による確認に使用した（方法17．）。残りを滅菌水で100
μ1としてフェノール・クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿後、
100μ1のproteinase　K反応液｛10mM　Tris－HCI（pH8．0）、5mM
EDTA、　O．5％SDS、5μg　proteinase　K｝中で37℃、30分間保温し
　　　　　　　　　　　　　　　104
憲
¶
1 2 3　　4 5　　6 7
含
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懸
盤
2
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馳
dLトー一　　幽』．．　　一
適b＿　　　一一　　一
図19　SgUとSgLの両方が検出される罹病イネから
　　　トビイロウンカ各個体で伝搬したRRSVのゲノム
1と21SgUだけが検出される罹病イネを用いて保毒させた
　　　　トビイロウンカ各個体から伝搬したRRSVのゲノム
3－7：SgUとSgLの両方が検出される罹病イネを用いて
　　　　保毒させたトビイロ：ウンカ各個体から伝搬した
　　　　RRSVのゲノム
　保毒トビイロウンカ各個体でRRSVをイネに接種した。
　発病したイネから個体別に抽出したdsRNAを
　10％SDS－PAGEに供試し、銀染色をした。
105
h“・・ヨ雛踊灘、
た．フェノー一・・ル・クロロフォルムで抽出後、エタノール沈殿し、全量
50μ1系でEcoRIとPstIを反応させ、再びエタノール沈殿し、
pUCII9に挿入した（方法15．）。このプラスミドを大腸菌から抽出し
（方法16．）、再びEco　R　IとPs亡1で挿入部位を切り出し、　pMAL－c2
のEco　R　IとPs亡1部位の問に挿入してpMAL－S9を作成した（方法
15．）　（図6）。合成したプライマー（dGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGC
C）を使用してpMAL－S9のEcoRI挿入開始部位、約200塩基の配列
を確認した（方法19．）。pMAL－S9で形質転換した大腸菌JM83と対照
として形質転換していない大腸菌JM83を2mlの2×YT（醐AL－S9の形
質転換体には50μg／mlアンピシリンを含む）に接種し、37℃で一晩
振盈培養した．培養液10μ1を0，1mM　IPTGを含むRich　medium（1
％TryPtone、0・5％Yeast　extract、0．5％塩化ナトリウム）
2皿1に接種し、23℃で約5時間振旦培養し、pMAL－S9で形質転換した
大腸菌は250μ1、形質転換していない大腸菌は500μ1の培養液をマイ
クロ遠心チュv一・’一’・ブに移した。卓上遠心機で8，000rpmで2分間遠心分離
し、沈殿をTE　25μ1に懸濁した。　SDS－PAGE用に試料を調整し、
pMAL－S9で形質転換した大腸菌は5μ1、形質転換していない大腸菌は
7μ1を12・5％SDS－PAGEに供試した（方法20，）　（図20レーン2、
3）・サイズマーカーは3．5μ1を供試した。泳動後：、ゲルの銀染色を
してタンパク質のバンドを検出した（方法20．）。塩基配列をもとに
したP9の推定分子量は約38KDaであり、マルトース結合タンパク質
106
岡山　　　灘灘・・
唾
　
欝
驚
　
　
巌
，
灘
．
　（MBP）（約42KDa）との融合タンパク質（MBP－P9）の推定分子量は約
80KDaである．　pMAL－S9で形質転換した大腸菌タンパク質中に約
81KDaのバンドが特異的に認められた。　MBP－P9を大腸菌タンパク質か
ら分離精製し（方法2L）、波長280nmの吸光度を測定してMBP－P9の
濃度を算出した。精製したMBP－P9を透析溶液　｛10mM　Tris－HC1
（pH8．0）、IOOmM塩化ナトリウム1で透析し（方法25，）、その
100μ1（約40μg）に1μg／μlFactorXa　1μ1を混合し、約20時
間室温で反応させた。透析したMBP－P9とFactorXaで処理した試料を
SDS－PAGE用に調整してそれぞれ10μ1を上記の12．5％SDS－PAGEで
解析した（方法20．）　（図20レーン4、5）．大腸菌タンパク質から分
離したMBP－P9と、　FactorXaで切り離したMBPとP9が確認できた。　P9
はサイズマーカーとその移動度からすると約36，2KDaであった。　RRSV
には35KDaの構造タンパク質が報告されているので（Chen　e亡a1．，
1989b）、これらの移動度を比較することにした。　RRSV粒子は罹病イ
ネから純化し（方法2．）、SDS－PAGE用に調整した。純化は100gの罹
病イネを材料にしたが、収量が少なく濃度測定できなかったのでここ
では全量を最終20μ1に調整し、10μ1を上記の12．5％SDS－PAGEで
解析した（方法20．）　（図20レーン6）。FactorXaによってMBPと分
離して作られるP9にはN末端にプラスミド由来の4アミノ酸が付加され
ているため、大腸菌で発現したP9は35KDaの構造タンパク質よりわず
かに移動度が遅かったが、ほぼ同じ移動度を示した。
107
灘
蹴
羅
霧
出
離
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2：非形質転換体
3：大腸菌をpMAL－S9で形質転換し、　MBP－P9の発現を誘導
　　したもの
4：アミロースレジンによって大腸菌タンパク質から分離
　　したMBP－P9
5：P9を分離するためFactorXaで処理したMBP－P9
6：RRSV純化粒子
各タンパク質を12．5％SDS－PAGEに供試して、銀染色をした。
MBP－P9、　MBP、　P9の位置をまとめて右側の矢印で示した。
108
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⑧P9と抗RRSV粒子抗体の反応
　P9はその分子量がほぼ同じであったことからChen　e亡al，
（1989b）の35KDaの構造タンパク質であると推測し、抗RRSV粒子抗
体を用いてウェスタンプロッティングで確かめることにした（方法
20．）。　各タンパク質を図20同様に電気泳動後、ゲルからPVDFメン
ブレンに転写した。　一次抗体には70μ9／ml抗RRSV粒子抗体を使用
し、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体を使用した。
Konica　immunostaining　HRD　Kitでペルオキシダーゼを検出したと
ころ、MBP－P9とFactorXaによって分離したP9に反応が現れた（図
21）　o
⑨RRSVの構造タンパク質，｝　MBP－P9に対するポリクローナル抗体（抗
MBP－P9抗体）の反応
　P9は35KDaの構造タンパク質であることを更に確かめるため、　MBP－
P9に対する抗体を作成して、　RRSVの35KDaの構造タンパク質の反応を
ウェスタンプロッティングで調べることにした（方法20．）。ウサギ
を免疫するため、大腸菌タンパク質から分離精製したMBP－Pg　lOOμ9
を不完全アジュパンド（DIFCO）に乳化し、後肢のふくらはぎに筋肉
注射した。10日間隔で2回筋肉注射し、その10日間後に100μgを耳に
静脈注射した。3日後、耳から採血して37℃で約1時間、次に6－10℃に
移して一晩静置した。SAKUMA　Mode190－22で3，000rpm、5分間遠心
　　　　　　　　　　　　　　　109
鑛 灘灘　＿．藻
分離して血球成分と分離し、上澄みの血清を再度3，000rpmで15分間
遠心分離して残りの血球成分を除いた。12，5％SDS－PAGEには上記同
様に精製したMBP－P9とFactorXaで処理したMBP－P9の他、　TEで8倍希
釈してSDS－PAGE用に調整後、5倍希釈したサイズマー一…カー3μ1を供
試した。RRSV粒子は罹病イネから純化し（方法2．）、SDS－PAGE用に
調整した。純化は1009の罹病イネを材料にしたが、収量が少なく濃度
測定できなかったのでここでは全量を最終100μ1に調整し、5μ1を供
試した。電気泳動後、タンパク質はゲルからPVDFメンブレンに転写し
た。一次抗体には血清を15倍希釈で使用し、二次抗体には西洋ワサビ
ペルオキシダ・・一・…ゼ結合抗体を使用した。Konica　immunostaining
HRD　Kitでペルオキシダーゼを検出したところ、　MBP－P9、　FactorXa
によって分離したMBPとP9、　RRSVの35KDaの構造タンパク質に反応が
認められた（図22）。
・
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郷
轍
⑩SgL　RRSVの伝搬効率
　SgLの843番目の塩基置換は338アミノ酸からなるP9の277番目のア
ミノ酸を変える。また、35KDaの構造タンパク質は粒子の表面にある
と考えられており（Hagiwara　etal．，1986；Chen　etaL，
1989b）、ウイルスの細胞への侵入に関与していることもありうる。
そこで伝搬効率にこの置換が影響しているかどうかを確認することに
した。この実験の最初にはSgL　RRSVが得られていなかったのでSgU
110
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RRSVとSgL　RRSVに混合感染していたイネを獲得源にしてトビイロウ
ンカによる保毒率とイネへの伝搬率をSgU　RRSV単独感染の場合と比較
した。1本植えにした罹病イネで若齢のトビイロ：ウンカを4日間獲得吸
血させ、潜伏期間として健全イネで10日間育成後、イネの幼苗で個体
別に2日間接種吸込させた。獲得源はウイルスの接種時期が同じで病徴
が同程度のものを組として、全部で4組（J－1とJ－3、J－2とJ－4、
YIE6とY85－1、　Y3とY85－2）を比較した。保毒トビイロウンカは
ELISAで検出し（方法3．）、イネは一ヶ月以上温室で育成後、病徴観
察あるいはELISAで罹病個体を検出した（方法3．）。保毒率は接種に
用いたトビイロウンカ50個体に対する保毒トビイロウンカ、伝搬率は
接種イネ50個体に対する罹病イネを算出して図23に示した。この試験
では顕著な違いが見られなかった。そこでSgL　RRSVであるRRSV－Pと
SgU　RRSVであるRRSV－Hで比較することにした。それぞれの獲得源を
同じ状態にするために、まず、RRSV－PとRRSV－Hを北大のトビイロウ
ンカでイネ（品種、金南風）に伝搬させた（この際は上記同様に獲得
吸汁と潜伏期間をとり、トビイロウンカの集団でイネに伝搬させた）。
約一ヶ月間、接種したイネを温室で育成し、病目が同程度に現れたイ
ネで若齢トビイロウンカを3日間獲得吸汁させた。トビイロウンカは
RRSV－PとRRSV－Hそれぞれにつき北大のものとフィリピンのものを用
い、潜伏期間として健全イネで10日間育成後、トビイロウンカを個体
別に2日間イネの幼苗で接種豆汁させた。獲得源に使用した罹病イネは
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株全体を磨砕してELISAでウイルス濃度を比較した（方法3，）。
ELISAでは同じ時間だけ発色を行い、波長415nmの吸光度を測定した
ところ、RRSV－Hは約2．0でRRSV－Pは約1．3であった。　i接種：したイネは
生育状態が悪く、枯死したので伝搬率は分からなかったが、トビイロ
ウンカは各区につき25頭をELISAで調べ（方法3，）、保毒率を算出し
た（図24A）。北大のトビイロ：ウンカではRRSV－P（20％）より
RRSV－H（36％）の方が保毒忌がわずかに高く、フィリピンのトビイロ
ウンカでは逆にRRSV－H（0％）よりRRSV－P（16％）の方が保毒率が高
かった。更に、RRSV－Hから分離したSgL　RRSVを用いて同様に保毒率
を比較した。北大のトビイロウンカの場合、SgU　RRSVの73％に対し
SgL　RRSVでは76％で差がなかった。また、この試験ではRRSV－Pも用
いたが、義訓率は27％であった。（但し、この場合は獲得吸汁と潜伏
期間の日長処理が事故のため通常とは違って24時間照明であった）
（図24B）。フィリピンのトビイロ：ウンカの場合はRRSV－HのSgU
RRSVで23％に対しSgL　RRSVでは30％で差がなかった。また、この試
験：でRRSV－Pの保毒心は23％であった（図24　C）。
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論議
　RRSV－HのSgUに対して、　RRSV－PとRRSV－H（分離したもの）のSgL
には塩基の血塗はなく、それぞれ2カ所と3カ所の置換しか認められな
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　図23SgU　RRSV罹病イネとSgU　RRSVとSgL　RRSVの罹病イネにおける
　　　RRSV保毒率と伝搬率の比較
それぞれはRRSV罹病イネ個体で、　UはSgU　RRSV、　U＋LはSgU　RRSVと
SgL　RRSVの混合感染株を獲得源に用いたことを示す。
保毒率＝RRSV保毒虫個体／全個体、伝搬率＝RRSV感染イネ個体／接種個
体の百分率をグラフに表示した。
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図24（A）SgU　RRSV罹病イネとSgL　RRSV罹病イネにおける保毒
　　　　率の比較
RRSV｝HのSgU　RRSV（HU）とRRSV－PのSgL　RRSV（PL＞を獲得
源として、北大のトビイロウンカ（H）とフィリピンのトビイロ
ウンカ（P）に獲得させた。各区は“獲得源一トビイロウンカ・
で表示した・保毒率＝RRSV保毒虫個体／全個体の百分率をグラフ
にした。
114
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図24（B）北大のトビイロウンカによるSgU　RRSV罹病イネ
　　　　とSgL　RRSV罹病イネの保毒率の比較
　　RRSV－HのSgU　RRSV（HU）とSgL　RRSV（HL）、
　　RRSV－PのSgL　RRSV（PL）を獲得源として、北大
　　のトビイロウンカに獲得させた。
　　保毒率＝RRSV保毒虫個体／全個体の百分率をグラフにした。
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図24（C）フィリピンのトビイロウンカによるSgU　RRSV
　　　　罹病イネとSgL　RRSV罹病イネの保毒率の比較
RRSV－HのSgU　RRSV（HU）とSgL　RRSV（HL）、
RRSV－PのSgL　RRSV（PL）を獲得源として、フィリピンの
トビイロウンカに獲得させた。
保毒率＝・RRSV保毒虫個体／全個体の百分率をグラフにした。
115
かった（図13）・SgLには843番目のアデニンからシトシンへの置換が
共通して見つかったことから843番目だけが異なるS9を合成してPAGE
で比較した結果・843番目がA：UのS9はSgU、　C：GのS9はSgLと同様の
移動度を示した・従って、843番目の一塩基対の置換がPAGE上でS9の
移動度を変える原因であることが明らかになった。RRSV－Tとインドの
RRSV（RRSV－1）でS9の塩基配列が決定された（Upadhyaya　e亡al，，
1995）。その結果、RRSV－TのSgLの843番目もシトシンであることが
分かった。また、RRSV－1の843番目もシトシンであることからSgLを
持つと推測される．通常、PAGEでは分子量の小さいものは移動度が早
い。　しかし、A：U（ATP＋UTP・991．4Da）はC：G（CTP＋GTP、
1006．4Da）より分子量が小さいにもかかわらず、　A：Uを持つSgUは
C：Gを持つSgLよりPAGE上で移動度が遅かった。更に、　RRSVのS9は
SlOより30塩基対少ないにもかかわらず、　PAGE上では移動度が遅い
　（図14）　（Uyeda　eta1．，1995b；Yan　eta1．，1995）。同様の現
象はWTVのS4とS5・S6とS7、　RDVのS4とS5、　S9とSlOにも認められて
いることから（Suzuki，1995；Nuss　and　Da11，1990）、PAGE上
の移動度が分子量だけで決定されているわけではないと考えられる。
PAGE上で移動度が異なっていたRDVのS12には塩基の置換のみが認め
られ・欠損や挿入はなかった（Murao　eta1．，1994）。また、　PAGE
上の移動度が異なっていたrotavirusのS8には1塩基対の置換しか検
出されなかった（Dunn　etal・・1993）。これらの結果は塩基対の置
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穣憲’・
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藩
換にはPAGE上の移動度に影響を与えるものがあることを示している。
PAGE上の移動度に影響する因子として、　dsDNAと同様にdsRNAが局部
的に曲がることが考えられた（Wu　and　Crothers，1984）。
　SgUを持つRRSV（SgU　RRSV）とSgLを持つRRSV（SgL　RRSV）が混
合感染したイネをRRSVの獲得源とした場合、最初の伝搬実験では、伝
搬後のイネにSgU　RRSVしか検出できなかった（Yan，1992）。本研
究では同様に混合感染したイネを獲得源にした場合、SSCPによって
SgUのみsあるいはSgLのみ、あるいはそれら両方が検出されるトビイ
ロウンカ個体があった（図18）。RRSVはトビイロウンカ体内で増殖す
ると考えられている（Milne　eta1．，1982）。SgUとSgLが検出され
るトビイロウンカ個体があったことは保毒の段階でこれらのRRSVでは
干渉は起こらなかったことを示す。また、それはイネでも同様である
｛図19）・RRSV｝Hから押したSgL　RRSVは以後の試験で騨独で伝
搬した．従って、最初の実験では（Yan，1992）多くの個体を調べる
のが困難であったために・SgL　RRSVが検出できなかったと考えられる。
本実験ではSSCPによって多くの個体の判定が可能となった。別の系統
のウイルスが宿主に混合感染した場合に片方の病徴しか現れないこと
がある（Giddings・1949）・そのような場合、ゲノムを対象にして
簡便に解析できることから・SSCPが有効であると考えられる。植物レ
オウイルスは宿主で局部病班を形成せず、また、媒介昆虫の細胞にも
プラークを作らないことから、混合感染しているウイルスを分離する
117
裡
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　のは困難だった．しかし、媒介昆虫の個体別接種をすることで、分離
　できることが明らかになった。
　RRSV－HのSgUのORFには338アミノ酸からなる38．6KDaのタンノSlク質
　（P9）がコードされている（Yan，1992）。SgLのアミノ酸配列はわ
ずかに異なるが｛RRSV－H（158番目Asn→Ser、277番目Asp→
Ala）・RRSV－P（108番目Va1→11e、277番目Asp→Ala）、RRSV＿T
　（277番目Asp→Ala）、RRSV－1（171番目Ala→Thr、191番目Asn→
Se「・277番目Asp→Ala）｝・すべてにナンセンス変異はなく、ORFは
保存されていた（図12・図13）（Upadhyaya　e亡a1．，1995）．従っ
て、RRSVにとってP9は重要な機能を果たしていると考えられる。大腸
菌で発現させたP9はSDS－PAGEでの移動度がRRSVの35KDaの構造タン
パク質とほぼ同じだった（図20）。また、抗RRsV粒子抗体は発現した
P9に反応し、　MBP－P9に対する抗体はRRSVの35KDaの構造タンパク質
と反応した（図21・図22）・これらのことからP9はRRSVの35KDaの構
造タンパク質であることが明らかとなった。また、RRSV－Tを用いても
同様の結果が得られている（Upadhyaya　eta1．，1995）。分子量と
他の構造タンパク質との量比からすると、RRSVの35KDaの構造タンパ
ク質にはERSVの34KDaの構造タンパク質が対応している（図10）。推
定分子量からすると・ERSVの34KDaの構造タンパク質はS9あるいは
SlOにコv”一’ドされている可能性がある（表5）。PAGEによってERSVと
RRSVのセグメントの移動度を比較すると、　S9ではERSVの方がRRSVよ
118
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　りわずかに早いのに対し、S10ではERSVの方がRRSVよりわずかに遅い
　（Chen　et　a1・・1989）・従って、　ERSVのS9はRRSVのS9よりわずか
に分子量の小さいタンパク質を、S10はRRSVのS10よりわずかに大き
いタンパク質をコードすると予想される。ERSVのS9と34KDaの構造タ
ンパク質は共にRRSVのS9とP9より小さいことから、　ERSVでもS9が
34KDaの構造タンパク質をコードしている可能性が高いと考えられる。
多くの植物ウイルスでは構造タンパク質の遺伝子を宿主植物に導入す
ると抵抗性になることが知られている。RRSVのP9は構造タンパク質で
あることから、RRSV－PのSgLのmRNAを発現するイネが作成されたが、
そのイネは抵抗性を示さず、SgU　RRSVに感染した（Matsumura　and
Ta　bayash　i，1995）。また、　RDVでは媒介昆虫に2種類ウイルスを注
射することによってセグメントの交換（遺伝的閉集合）が起こること
から（Uyeda　et　a1・・1995a）、SgLのmRNAの存在下で増殖したRRSV
にはSgLが格納されていることが期待された。しかし、増殖したRRSV
には、SgUしか検出されなかった（Matsumura　and　Tabayashi，
1995）　o
　ウイルスは通常、粒子表面のタンパク質と宿主細胞のレセプターを
介して細胞内に侵入する・P9は粒子の表面にあると考えられている
（Hagiwara　et　a1・・199・）・RRSV　一一　P（SgL　RRSV）のP9のアミノ酸
配列はsguのP9と一部異なっており、継代の際に伝搬性が低いとされ
ていた・そこでこれらのアミノ酸置換が伝搬性に影響していることが
119
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考えられたが・北大とフィリピン、どちらのトビイロウンカを用いた
場合でもSgU　RRSVとSgL　RRSVの保毒率に違いはなかった。フィリピ
ンのトビイロウンカは1回目の試験ではSgU　RRSVを全く保毒しなかっ
たのに対し、2回目の試験では23％が保毒した。試験の際の条件は一
定だが・獲得源の罹病イネは試験で枯死するため、同一の罹病イネを
用いることができない。また、トビイロウンカは継代によって維持し
なければならないので世代交代している。1回目と2回目の試験で保毒
率が異なった理由として試験数が25個体と少なかったこと、獲得源の
状態が異なったこと、トビイロウンカ集団が北大の環境に適応して変
化したことなどが考えられた。北大のトビイロウンカの場合、1回目と
2回目両方の試験でRRSV－PよりRRSV－Hの方が下下率が高かったが（1
回目、20％に対し36％）　（2回目、27％に対し73％）　（図24A、　B、
C）、1回目の違いはわずかで2回目の試験では獲得吸汁と潜伏期間の
照明が事故のため24時間であったことから通常の日長（16時間）と違っ
ていた・従って・北大のトビイロウンカでは正確な比較ができなかっ
たが、これら2回の試験でRRSV－Pを保毒できることが分かった。以上
の結果からSgUとSgLで見られるのP9のアミノ酸変化がRRSVのトビイ
ロウンカによる保毒率に大きく影響することはないと考えられた。
耐
傷
3．S10の解析
120
　　さ　オ　　　　　　ヲ
難難 纒；駿・ 雛
、灘　　　簸，
一冒．既
　　ゲノムに対するcDNAがクロ　一一ニングされ、　SlOの全塩基配列が決定
　された（Yan　eta1．，1995）。　1162塩基対からなるS10の片方の鎖
の142－1035番目（主要なORF）には297アミノ酸からなる32．4KDaの
タンパク質（PlO）がコードされている（図25）。P10は一番分子量の
小さい構造タンパク質のP9より分子量が小さいことから非構造タンパ
ク質と予想される。そこでPlOではRRSV罹病イネ及び、保毒トビイロ
ウンカからの検出を試みた・S10には主要なORFの上流に12アミノ酸か
らなる小さいORF（S10mini）が存在する。　RDVのS1にも主要なORFの
上流に7アミノ酸からなる小さいORFが存在する（Suzuki　eta1．，
1992）。通常、真核生物のmRNAには1つのORFがあり、5t側のAUGが
翻訳の開始コドンとして働く。但し、開始コドンとしての認識される
にはAUGの周りの塩基も関与し、　XNNAUGYのX（一3位）にはプリン基、
Y（＋4位）にはグアニンが適しているとされている（Kozak説）
　（Kozak，1981）。RDVのS1の小さいORFの開始コドンはKozak説に
よると適していない（一3位C、＋4位A）。小さいORFの発現は分かって
いないが・下流の主要なORFの発現産物（P1）は保毒ツマグロ：ヨコバ
イと罹病イネの両方で検出された（Suzuki　eta1．，1994）。RRSVの
S10の場合・Kozak説によると、主要なORFの方がS10miniより適して
いる（SIOminiは一3位U・＋4位C、主要なORFは一3位A、÷4位C）。しか
し・AUGが開始コドンとしての認識されるには51末端からの距離も重
要とされている（Kozak・1991｝．これまでに発現が確認されたセグ
121
一灘
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・
醸
．
携
GATAAATCTTCCGAGCTAA
CCC　GCA　TAG　CTG
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　M　　P　　F　　V
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GAA　　　　　TTG　AAA　TGT　GAA　GTT　TGG　ACT　GAT　TTG　CTA
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　CCT　GAG　CAA　GAT　GAT　ATG　CTG　TCT　GGA　GTT　TTT
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GcTGATCTCGATTAGcTAGGGcTAGGcTGAAAAGGAAGAGAeACAe6i66
図25 RRSVのSlOに対するcDNAの塩基配列と読み取り枠のアミノ酸配列
122
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繧
ぴ
懇
懇
．
麟
、
． 鮨捻融，魂鋤醐醐
メントによれば｛RDVの各セグメント（S2の15－17番目からS4の64－
66番目）とRRSVのS9（14－16番目）｝、SlOmini（20－22番目）の方
が主要なORF（142－144番目）より適していると考えられる。そこで
主要なORFの他、　SlOminiの発現も調べることにした。
、
「
謙
結果
纒
①SlOの主要なORFがコードするタンパク質（P10）の大腸菌による
発現
　まず・P10を大腸菌で発現させた。　RRSVのゲノム2，5μ9をDMSO
変性して鋳型とし（方法12．）、＋鎖の3’末端に相補の配列のプライ
マー（1149－1162番目にPst　1の認識配列を加えたdGGGCTGCAGCACCT
CTGTCTCTATGGTCTCGCCG）を用いて全量50μ1系の逆転写反応によっ
て37℃で2時間保温してS10の全長のcDNAを作成した（方法13，）。核
酸はフェノー・一・一ル・クロロフォルムで抽出してエタノール沈殿し、25
μ1の滅菌水に溶解した。その2μ1をPCRの鋳型とし（方法14．）、主
要なORFの始まりの塩基配列のプライマー・一・一・・一（142－156番目にEc。　R　I
の認識配列を加えたdGGGAATTCATGCCTTTCGTGCAA｝と＋鎖の3・末端
に相補の配列のプライマー・一・・一・・（1151－II62番目にXho　Iの認識配列を加
えたdCCTCGACACCTCTGTCT）をそれぞれ1μg用いて全量100μ1系の
PCRを行った（方法14．）。反応後、1／20量を1％アガロ：一スゲル電
123
一b、　鍵葱B
　気泳動による確認に使用した（方法17．）．残りを滅菌水で100μ1と
　してフェノール・クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿後、50
　μ1の滅菌水に溶解してpMAL－S9と同様にproteinase　Kで処理した。
核酸はフェノール・クロロフォルムで抽出後、工タノー・一’・ル沈殿し、全
量50μ1系でEcoRIとXhoIを反応させた。再びフェノ＿ル．クロ
ロフォルム抽出とエタノール沈殿を行い、pMAL－c2のEcoRIと
Sal　I部位の問にDNA断片を挿入してpMAL－SIOを作成した（方法
15・）　（図26）・塩基配列にもとづいて合成したプライマーを用いて
pMAL－SIOの挿入塩基配列を確認した（方法19，）。pMAL－S10で形質
転換した大腸菌JM83・対照としてpMAL－c2で形質転換した大腸菌JM83
と形質転換していない大腸菌JM83を2m1の2×YT（pMAL－SIOとpMAL－
c2形質転換体には50μ9／m1アンピシリンを含む）に接種し、37℃で
一晩振盗培養した。培養液200μ1を0，1mM　IPTGを含むRich
medium（1％Tryptone、0．5％Yeast　extract、0．5％塩化ナト
リウム）40mlに接種し、23℃で約9時間振印した培養液500μ1を
マイクロ遠心チューブに移した。卓上遠心機で8，000rpmで2分間遠心
分離し、沈殿をTE　25μ1に懸濁した。　SDS－PAGE用に試料を調整し、
7μ1を12．5％SDS－PAGEに供試した（方法20，）　（図27レーン2、
3・4）・サイズマーカーはTEで8倍に希釈し、　SDS－PAGE用に試料を調
整して4μ1を供試した・泳動後、ゲルをクマシーで染色してタンパク
質のバンドを検出した・塩基配列をもとにしたP10の推定分子量は約
124
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’購，一綴園圃総懸
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66．2：●●鶉紫191g”
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45．0：娼■■■P　　　　　嵩　静9剛一　　　　　剣■■■■P
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31・0働 奄於N
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21．5●■●　　　　　　　　　　　　　　　
一MBP－PIO
〈il｝’　MBP－LacZ　a
tMBP
＜トPlO
　　　図27大腸菌によるPlOの発現
1：サイズマーカー
2：非形質転換体
3： ｬ謄翻HAL－c2で三二良し・一MBP－LacZaの期を誘
4： ﾞ欝pMAL－S’0で高場巧し・一MBP－Pl・の発現を講
5： ﾑ泌齢占ジンカラムによって大E易菌タンパク質から艦
6：PlOを分離するためMBP－PIOをFactorXaで処理したもの
7： ﾑ温詮媛ンカラムによって大fi易菌タンパク質から分離
霊26
．　掌
32．4KDaであり、マルトt・一・一・ス結合タンパク質（MBP）（約42KDa）との
融合タンパク質（MBP－PIO）は約74，4KDaであると推定される。
pMAL－SIOで形質転換した大腸菌タンパク質中には約72KDaのバンドが
認められた・上記残りの培養液を用い、MBP－PIOを大腸菌タンパク質
から分離精製し（方法21．）、波長280nmの吸光度を測定してMBP－PIO
の濃度を算出した。精製したMBP－P10を透析溶液｛IOmM　Tris－HCl
　（pH8．0）、100mM塩化ナトリウム｝で透析し（方法25．）、その48
μ1（約48μg）に1μg／μlFactorXa　2μ1を混合し、約9時間室温
で反応させた。透析したMBP－PIO（1μg／μ1）とFactorXaで処理し
た試料をSDS－PAGE用に調整して、それぞれ5μ1を上記の12．5％
SDS－PAGEで解析した（方法20．）　（図27レーン5、6）。また、対照
としてpMAL－c2で形質転換した大腸菌についても同様に大腸菌タンパ
ク質からマルトース結合タンパク質（MBP）（約42KDa）とLacZ遺伝子
のαペプチドとの融合タンパク質（MBP－LacZα，約52KDa）を分離精
製して上記の12．5％SDS－PAGEに供試した（図27レーン7）。
Fact。rXaによって切り離したP10はサイズマーカーの移動度からする
と約33KDaであった。
灘
②S10の小さいORFがコードするタンパク質（PlO皿ini）の大腸菌に
よる発現
　SlOの小さいORF（S10mini）がコー・一・一…ドしているP10miniを大腸菌で
127
発現させた。S10の塩基配列の決定に使用したプラスミド（pUC119の
Ps亡1部位にSlOの1－967番目を挿入したもの）を大腸菌から抽出し
　（方法16・）・50μ1の滅菌水に溶解して1μ1をPCRの鋳型とした。
S10miniの始まりの塩基配列のプライマー（20－33番目にEcoRIの
認識配列を加えたdTTTGAATTCATGCCAATAAGCAG）と主要なORFのすぐ
上流に相補の配列のプライマー（128－141番目にPstIの認識配列を加
えたdAAACTGCAGGATTGATGGTTTTG）をそれぞれ1μg用いて全量
100μ1系のPCRを行った（方法14．）。1／20量を2％アガロースゲル
電気泳動による確認に使用した（方法17．）。ミネラルオイルを除く
ためクロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿後（但し、3M酢酸ナ
トリウムの代わりに7．5M酢酸アンモニウム50μ1を使用｝、核酸
を30μ1の滅菌水に溶解した。この20μ1を全量50μ1系でEcoRIと
PstIを反応させ・フェノーール・クロロフォルムで抽出し、上記同様
にエタノール沈殿した。核酸を20μ1の滅菌水に溶解し、再度エタノー
ル沈殿して20μ1の滅菌水に溶解し、1μ1を1％アガロ：v一’一・’スゲル電気
泳動に供試して核酸を確認した（方法17．）。DNA断片をpMAL－c2の
EcoRIとPstI部位に挿入するためにその2μ1をライゲーション反
応に使用した（方法15．）。PCRの際に鋳型としたプラスミドを除くたt
め・反応液をBamHIで処理してから大腸菌の形質転換に用いたが、
組み換えたプラスミドが得られなかった。また、プラスミドベクター
にpUC119を用いてみたが・やはり組み換えたプラスミドが得られなかっ
128
羅鴛’
た。そこで上記30μ1の残りの10μ1を全量40μ1で平滑末端化後
　（方法15．）、核酸を10μ1の滅菌水に溶解し、再度1μ1を1％アガ
ローースゲル電気泳動に供試して核酸を確認した（方法15．｝aDNA断片
をpUCl19のSma　I部位に挿入するためにその2μ1をライゲーション
反応に使用した（方法15・）。PCRの際に鋳型としたプラスミドを除く
ため・反応液をSma　Iで処理し、大腸菌を形質転換したところ、組み
換えたプラスミドが得られた。挿入部位の塩基配列を調べたところ
　（方法18．）、128－141番目にPst　1の認識配列を加えたプライマーの
Pst　Iの認識配列を含む部位ACTGCAGがTCAGとなっていたためPst　I
認識部位を利用して組み換えができなかったことが分かった。そこで
組み換えたプラスミドのマルチクローニング部位のPs亡1認識部位を
利用してEcoRI－PstI断片をpMAL－c2のEcoRIとPst　1部門にサ
ブクロ：一一ニングし、　pMAL－SIOminiを作成した（方法15，）　（図
26）。pMAL－SIOminiの挿入部位の塩基配列は合成したプライマー
（dGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC）を使用して確認した（方法
19・）・pMAL－SlOminiで形質転換した大腸菌JM83と、対照として
pMAL『c2で形質転換した大腸菌JM83、形質転換していない大腸菌JM83
を用いてpMAL－S9の場合と同様に発現させた。但し、発現の際は約10
時間振塗培養した・pMAL－SIOminiで形質転換した大腸菌とpMAL－c2
で形質転換した大腸菌の場合は培養液500μ1を、形質転換していな
い大腸菌の場合は250μ1をマイクロ遠心チューブに移した。卓上遠心
129
機で8，000rpmで2分間遠心分離し、沈殿をTE　lOOμ1に溶解した。
この試料をSDS－PAGE用調整し、4μ1を12，5％SDS－PAGEに供試した
　（方法20・）　（図28レーン2、6、7）．サイズマーカーはTEで16倍に
希釈し、SDS－PAGE用に試料を調整して3μ1を供試した。泳動後、ゲ
ルの銀染色をしてタンパク質のバンドを検出した（方法20．）。pMAL－
SlOminiで発現されるMBP－PIOminiはMBPに16アミノ酸（約1，7KDa）
を付加しているだけなので、その分子量（43．7KDa）はpMAL－c2の
MBP－LacZα（約52KDa）より小さい。実際に発現したMBP－PIOmini
の移動度はMBP－LacZαより早かった（図28レーン6）。発現した
MBP－P10miniをMBP－P10と同様に大腸菌タンパク質から分離を試みた
が（方法2L）・アミロースレジンカラムに吸着しなかった。そこで
大腸菌発現用ベクターをpGEX－3Xに換えることにした。　pMAL－
S10miniのEco　R　I一　Pst　1断片を平滑末端化してpGEX－3XのSma　I部
位にサブクローニングし、pGEX－SIOminiを作成した（方法15，）　（図
26）。pGEX－SIOminiの挿入部位の塩基配列はPCRに使用したプライ
マーを用いて確認した（方法19．）．pGEX－SlOminiで形質転換した大
腸菌JM83を用いてpMAL－S10の場合と同様に発現を行った。但し、発
現の際は約12時間振盈培養した。培養液lm1をマイクロ遠心チュ＿
ブに移し・卓上遠心機で8・000rpmで2分間遠心分離した。沈殿をTE
75μ1に懸濁してSDS－PAGE用に試料を調整し、4μ1を上記の12。5％
SDS－PAGEに供試した（方法20．）　（図28レーン3）。pGEX－SIOmini
130
，器な
灘
（KDa＞　1
9　7．　4
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45，0　一i．一）
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〈ql｝一MBP－PIOmini
　GST－PIOmini殺
　GST
．薯．
21，5　N
　　　図28大腸菌によるPlOminiの発現
1：サイズマーカー一
2：非形質転換体
3：大腸菌をpGEX－SIOminiで形質転換し、　GST－PIOminiの
　　発現を誘導したもの
4：グルタチオンアガロースビーズによって大腸菌タンパク質
　から分離したGST－PIOmini
5： ?’n’を朧するためGST－P’Om’niをFact・rXaで処理した
6： I野齢S’Om’n’で形驚換し・MBP－Pl・miniの発現
7： ﾛ幣をpMAL－c2で形驚換し・MBP－LacZαの獺を誘導し
各タンパク質を12．5％SDS－PAGEに供試し、銀染色をした。
HBP－LacZα、　MBP－PIOmini、　GST－PIOmini、　GSTの位置を
まとめて右側の矢印で示した。
131
購
一
で発現されるグルタチオンーS一トランスフェラーゼーPIOmini（GST．
P10mini）はGST（27・5KDa）に18アミノ酸（約1．8KDa）を付加して
いるのでその分子量は約29．3KDaである。　SDS　一一　PAGEによってほぼその
分子量を持つ誘導特異的なタンパク質が確認できた。そこで残りの培
養液を用い、GST－PIOminiを大腸菌タンパク質から分離精製し（方法
22．）、波長280nmの吸光度を測定してGST－PIOminiの濃度を算出し
た。精製したGST－PIOmini（0．78μg／μ1）20μ1にIM塩化ナトリ
ウム4μ1．25mM　CaC1，1μ1、1μg／μlFactorXa　lμ1を混合し
て室温で2時間反応させた．精製したGST－PIOminiとFactorXaで処理
した試料を0．1μg／μ1にしてからSDS－PAGE用に調整してそれぞれ4
μ1を上記の12．5％SDS－PAGEで解析した（方法20．）　（図28レーン
4・5）・FactorXaによって分離したPlOmini（約し8KDa）は確認で
きなかったが、切り離したことでGST－P10miniより分子量が少しだけ
小さくなったGSTが確認できた。
腱
，
　
縢
難
③P10とPlOminiの検出
　まず、イネがRRSVに感染した場合あるいはトビイロウンカがRRSVを
保毒した場合に特異的なタンパク質ができているかをSDS－PAGEで調べ
た・健全イネと罹病イネは4倍量（V／W）の0．02M　PBS－Tween中で磨
砕した・また・罹病イネの腫瘍部位を集めて同様に磨砕した。トビイ
ロウンカは1×STE　180μ1中で磨遣し、　ELISAで陽性を示した試料を
132
一vdML
保毒虫として使用した（方法3．）。また、対照としてRRSVを保毒させ
ていないトビイロウンカを同様に磨遇した。これらをSDS－PAGE用に調
整してそれぞれ10μ1を12．5％SDS－PAGEに供試した（方法20．）。
上記の他・サイズマーカーはTEで26倍に希釈し、　SDS－PAGE用に調整
して10μ1を供試した。また、純化したRRSV粒子（方法2．）　1．4μg
をSDS－PAGE用に調整して供試した。泳動後、ゲルの銀染色をしてタン
パク質のバンドを検出した（方法20．）　（図29レーン1、4、5、6、
7、8、9）。　大腸菌で発現させたPlOはSDS－PAGEでの移動度がP9よ
り早かった。イネがRRSVに感染した場合とトビイロウンカがRRSVを保
毒した場合で、特異的なタンパク質は認められなかった。そこでMBP－
Ploに対するポリクローナル抗体（抗MBP－Plo抗体）とGsT－Plomini
に対するポリクローナル抗体（抗GST－P10mini抗体）を作成した。抗
原量と注射の期間はMBP－P9の際と同様であるが、　GST－P10miniの場
合は分離後、透析でグルタチオンを除去しなかったので、筋肉注射の
際は5倍、ブースターの際は2倍に50mM　Tris－HCI（pH8．0）溶液で希
釈して用いた．抗MBP－PIO抗体の場合、　P10に対するポリクローナル
抗体が含まれていることはFactorXaで切り離されたP10との反応によっ
て確認できる・しかし・抗GST－PIOminiの場合はP10miniの分子量が
小さいために同様の確認ができない。そこでこの場合は、MBP－
P10miniとの反応で確認することにした（方法20．）。上記のMBP－
PIOminiの発現を解析した際と同様に電気泳動を行った。但し、供試
133
瀧
．
”・・
ut
（KDa）　1　　2　3　4　5　6　7　8　9
　　　　　　　　　馴一　　一一一　　　　　　　，
書ぎ：街噛　　§婁一茎≡一ジ
　　　　　　～§§一…葺一
31，0＼剛・
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　　　　，iMniiiiii）
　　　　　　　　　　　　　　　　一
　　　　　　　　　　　　　　　　一　　　　 　 　剣■隔■■闇■■■　 ●■圏■■■b　　舳＿ 　　噸
21，sN
一P9
＜卜PlO
－GST－PIOmini
’一’t一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一S1SL一一N．“b一．．一一一一一一．．一一．一一一一一H．
図29　RRSV罹病イネ及び保毒トビイロ：ウンカのタンパク質
　1：サイズマーカー
　2：グルタチオンアガローースビーズによって大腸菌タン
　　　パク質から分離したGST－P10mini
　3：P10を分離するためMBP－PIOをFactorXaで処理した
　　　もの
　4：健全イネ
　5：RRSV罹病イネ
　6：腫瘍部
　7：保毒していないトビイロウンカ
　8：保毒しているトビイロウンカ
　9：RRSV純化粒子
各タンパク質を12．5％SDS－PAGE後、銀染色をした。
P9、　PIO、　GST－PIOminiの位置をまとめて右側の矢印
で示した。
134
藻糠
　した試料の量は上記の半分である。泳動後、タンパク質をゲルから
PVDFメンブレンに転写した。一一次抗体にGST－PlOminiを抗原とした血
清を750倍希釈で使用し、二次抗体にはアルカリフォスファタ”，一・・…ゼ結
合抗体を使用した・NBTとBCIPでアルカリフォスファターゼを検出し
たところ・MBP－PIOminiに反応が現れた（図30）。従って、抗GST－
P10mini抗体中にP10miniに対するポリクローナル抗体が含まれてい
ることが確認できた．そこでPlOとPlOminiを検出するためにこれら
の抗体を用いてウェスタンブロ：ッティングを行った（方法20．）。抗
体の陽性対照としてそれぞれGST－PlOminiとFactorXaで処理した
MBP－P10を用いるため、あらかじめ各0，3μgをSDS－PAGE用に調整し
て上記の12．5％SDS－PAGEに供試しておいた（図29レーン2、3）。
P10を検出するために図29と同様に12．5％SDS－PAGEを行った。但し、
この場合はGST－PIOminiは供試しなかった。泳動後、タンパク質をゲ
ルからPVDFメンブレンに転写した。　一次抗体にはMBP－PIOの血清を
150倍希釈で使用し・二次抗体にはアルカリフォスファターゼ結合抗
体を使用した・NBTとBCIPでアルカリフォスファター一・一…Lゼを検出したと
ころ・RRSVの構造タンパク質には反応がなかったが、　RRSVの罹病イネ
と腫瘍部位・保毒トビイロウンカの約34KDaのタンパク質に反応が現
れた（図31）・現れたバンドは全て同様にFactorXaで分離したPlOよ
り移動度が少し遅かった・また、腫瘍部位の試料、トビイロウンカ、
罹病イネの順で反応が強かった。次に、PlOminiを検出するために図
135
同旨、灘　　鑛
1　　2 3 4 5 6 7
tMBP－PIOmini
r圏■■D　剣■■9
　　　　　　一 ＜咽卜GST－PlOmini
N）〈　GsT
図30　抗GST－PIOmini抗体とMBP－PlOminiの反応
　1：サイズマーカー
　2：非形質転換体
　3：大腸菌をpGEX－SIO皿iniで形質転換し、　GST－P10miniの
　　　発現を誘導したもの
　4：グルタチオンアガロースビーズによって大腸菌タンパク質から
　　　分離したGST－PlOmini
　5：P10miniを分離するためGST－PlOminiをFactorXaで処理した
　　　もの
　6：大腸菌をpMAL－SIOminiで形質転換し、　MBP－PIOminiの
　　　発現を誘導したもの
　7：大腸菌をpMAL－c2で形質転換し、　MBP－LacZαの
　　　発現を誘導したもの
難謬聾勉認㌶写繋蔀1も螺霧亀友慮ぎ棚晒
タンパク質に結合した抗体はアルカリフォスファターゼ結合抗体
を用い、NBTとBcIPで検出した。　MBP－Plomini、　GsT－Plomini、
GSTの位置をまとめて右側の矢印で示した。
136
灘灘蛛@　灘灘1
　
　
　
　
　
　
　
…
　
　
　
　
　
　
　
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鱒
．
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郷
的
賎
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　図31RRSV罹病イネ及び保毒トビイロウンカからP10の検出
　　　　1：サイズマ・・一・一“カー
　　　　2：P10を分離するためMBP－PIOをFactorXaで処理
　　　　　　したもの
　　　　3：健全イネ
　　　　4：RRSV罹病イネ
　　　　5：腫瘍部
　　　　6：保毒していないトビイロウンカ
　　　　7：保毒しているトビイロウンカ
　　　　8：RRSV純化粒子
図29と同様に各タンパク質を12．5％SDS－PAGE後：（但し、
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　GST－
PIOminiを除く）・タンパク質をPVDFメンブレンに移して抗MBP－
P10抗体と反応させた・タンパク質に結合した抗体はアルカリフォ
スファターゼ結合抗体を用い、NBTとBCIPで検出した。検出した
腿讐話t）で溌現させたP1・の位置を（〈3一）で右側
137
難…鑛懸難難
詮Lt
灘
29と同様に12．5％SDS－PAGEを行った。但し、この場合はFactorXa
で処理したMBP－PlOを供試しなかった。泳動後、タンパク質をゲルか
らPVDFメンブレンに車云写した・一次抗体にはMBP－P1・の血清を75。倍
希釈で使用し・二次抗体にはアルカリフォスファターゼ結合抗体を使
用した・NBTとBCIPでアルカリフォスファターゼを検出したところ、
保毒トビイロウンカの泳動先端部に反応が現れた（図32）。
欝
④コムギ胚芽抽出液によるS10のmRNAの翻訳
　主要なORFは上記のように翻訳されていることが分かったが、
SlOminiに関しては分からない。そこでS10miniの開始コドンが機能
しているかどうかを試験管内での翻訳で確かめることにした。
SlOminiから翻訳されるP10miniは12アミノ酸で、上記のようにPAGE
による検出ができない・そこでS10miniを主要なORFの一部に連結し
たmRNAを作成することで新たにできる・RF（7KDa）の融合タンパク質
を検出することにした・mRNAの作成に1まpUCII9にSP6ポリメラ、．．．．．一ゼの
プロモーター配列を挿入して作られたプラスミドベクターpSP6を用O
た・pSP6に挿入するSl・のDNAは、　S1・miniの存在を確認するために
pUC119のPst　1部位にS10の1－967（Pst　I）番目までを挿入したプラ
スミドを利用した・まず・PstIで挿入断片を切り出して平滑末端化し、
pSP6のプロモーター配列のすぐ下流のStu　l部位にサブクn＿＝ング
した（方法15・）・次にpUC119のPst　1部位にS10の全長を挿入したプ
138
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ぐGST－PlOmini
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図32RRSV罹病イネ及び保毒トビイロウンカからPIOminiの検出
1：サイズマーカー
2：グルタチオンアガロー・一・・スビーズによって大腸菌タンパク
　　質から分離したGST－PIOmini
3：健全イネ
4：RRSV罹病イネ
5：腫瘍部
6：保毒していないトビイロウンカ
7：保毒しているトビイロウンカ
8：RRSV純化粒子
P10miniの位置を矢印で右側に示した。
139
・．靴 涛?』灘灘撚ρr
　ラスミド（Yan・1992）のHin　d　III断片を（S10の603番目から31
　末端領域を含めてマルチクローニング部位のHindIII）作成したプ
　ラスミドの3i末端領域を含まないHindIII領域と入れ換えてS10の
全長を挿入した（psp6－SIO　full）　（図33）。psp6－SlO　fullの挿
入塩基配列は塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて確認した
　（方法18・と19・）・更に、SlOminiを主要なORFに連結するため、
HincII（34－39番目）一　StyI（854－859）断片を除き、プラスミド
を平滑末端化してライゲ・一・・一・・ションし、psp6－S10De1を作成した（方法
15．）　（図33）。Sph　Iの認識配列は挿入したSlOの直ぐ下流に一カ所
しかないので・プラスミドをSph　Iで処理してから全量25μ1系の5・
末端にキャップを付加するSP6ポリメラーゼの転写反応に用いた（方
法26．）。反応後：、2μ1をアガロ・一一スゲル電気泳動に供試してmRNAを
確認後（方法17．）、鋳型DNAを除くため残りの反応液にDNase　I
70unitsを混合して37℃で30分間保温した。核酸をフェノール．ク
ロロフォルムで抽出してエタノール沈殿した（但し、3M酢酸ナトリ
ウムの代わりに試料2・・μ1に対して7．　5M酢酸アンモニウム27μ1
使用）・沈殿を3・2μ1の滅菌水に溶解後、67℃で10分間保温してから
急冷してmRNAを変性させた・この半量を全量12．5μ1系のコムギ胚芽
抽出液の翻訳反応に使用した（方法27．）。対照としてルシフェラ＿
ゼのmRNA　L6μ9を同様に反応させた。反応液の酢酸カリウムの濃
度が130mMta合は・対照としたルシフェラーゼが検出されたが、目的
140
灘
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灘
雛懸
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．EsLEHis：xssxsssssmesfiixxxmgxxisxsesggsym
　　図33RRSVのSlOの転写プラスミドの作成
pUCII9のEco　R　I部位にsp6プロモーター配列（Psp6）を挿入し、
孟？翻こ諜総説’£．fu’1）sあるいは中央部を欠損させた
141
纏二二灘畿欝織灘購灘欝翻騨醐i騨1「鰯灘・灘繭灘・
騨鯛■DJIJJ，・一一一『昌
の翻訳産物は検出されなかった。そこで酢酸カリウムの濃度は200mM
あるいは50mMとして25℃で2時間保温後、　SDS－PAGE用に調整してそれ
ぞれ15μ1を15％SDS－PAGEに供試した（方法20．）。サイズマーカー
は8倍に希釈し・SDS－PAGE用ここ試料を調整して4μ1を供試し、泳動1麦、
ゲルから切り取ってクマシーで染色した（方法20．）。残りのゲルを
AmplifyT罵（アマシャム社製）で処理後、オートラジオグラフィ＿に
かけた・反応液の酢酸カリウムの濃度が200mMta合には目的の翻訳産
物は検出されなかったが、50mMの場合には、対照のルシフェラーゼの
他・psp6－S10　Delにマーカーの中で一番分子量の小さい14．4KDaよ
りかなり小さい翻訳産物が検出された．その際psp6－S1・fu11｝こは
翻訳産物が検出されなかった（図10）。
譲
難
論議 総．
　大腸菌で発現させたP10のSDS－PAGEの移動度は一番小さい構造タン
パク質のP9より早かった（図29）。また、抗RRSV粒子抗体には反応せ
ず（結果は載せなかった）、逆に抗MBP－PIO抗体もRRSVの構造タンパ
ク質に反応しなかった（図31）。これらのことからP10は非構造タン
パク質と考えられる・抗MBP－PIO抗体を用いたウェスタンプロッティ
ングで罹病イネと保毒トビイロウンカに約34KDaのタンパク質が検出
されたことからP10が発現されていることが明らかとなった（図
142
藪　l　　j・蔚rtl
辮
〈KDa）　1　2　34　5　6　7　8
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31．〇一　　　　　　　　 Gレや　　　Q，
21，　5
14，　4
＜トルシフェラーーゼ
e
＜翻訳産物
図34S10のmRNAの試験管内での翻訳
1：ルシフェラーゼ／200mM　　　　5：ルシフェラーゼ／50mM
2　：　SIO／200mM　6　：　SIO／50mM
3　：　SIOD／200mM　7　：　SIOD／50mM
4：無し／200mM　　　　　　　　8：無し／50mM
　　　　“用いたmRNA／反応液中の酢酸カリウム濃度・で示した。
反応は合成したmRNAとコムギ胚芽抽出液を用い、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　翻訳産物には
3H－Metを取り込ませた。ルシフェラーゼは翻訳反応の確認のた
めに用いた・各反応液は15％SDS－PAGEに供試し、　X線フィルム
で翻訳産物を検出した。但し、サイズマーカー・一・・は切り取ってク
㌫灘扇奨朧瓢1レシフェラーゼと翻産物の位置
143
31）・現れたバンドの移動度は全て同様にFactorXaで分離したPIOよ
　り少し遅かった・タンパク質はリン酸化によってPAGEの移動度が少し
遅れる現象が知られていることから（Atkins　eta1．，1991）、P10
もその可能性が考えられる。また、罹病イネ全体より腫瘍部位の試料
で反応が強かったことからその部位でP10が多く発現していると考え
られる・RRSVの粒子は師部や腫瘍部位で多く観察されている
　（Shikata　eta1．，1979）。従って、　P10もそれらの部位で発現し、
RRSVの増殖に関与することが考えられる。昆虫で媒介をせずに宿主中
で長年保持し続けた植物レオウイルスは昆虫伝搬性を失うことがある
（Reddy　and　Black・1974；Kimura，1976）．WTVでは変異してい
たS5の解析の結果、5，末端より319塩基、3i末端より205塩基を残し
て中間が欠損していた（Anzola　eta1．，1987）。RRSVでも同様にし
て昆虫伝搬性を失ったウイルスが得られた。このRRSVのゲノム解析で
は・PAGE上の移動度が異常に早まっていたセグメントが見つかってお
り・それがS10であることが示唆されている。　（Maoka　e亡a1．，
1993）・末端共通配列はウイルスゲノムの複製、タンパク質発現、セ
グメントの格納などの機能に重要な役割を果たすと考えられているの
で（XUe亡a1．，1989）、S10も内部領域が欠損し、P10の発現が変化
していることが考えられる。
　上流のSIOminiを発現させてそれに対する抗体を作成した（図28、
図30）・罹病イネと保毒トビイロウンカで検出したPlOは大腸菌で発
144
MWiJJ，，一一
現させたP10よりPAGEの移動度が少し遅かったため、　PIOminiがPIO
に含まれている可能性も考えられた。しかし、この抗体は生体内の
PlOに反応しなかったことからその可能性は否定できる。また、この
抗体はRRSV保毒トビイロウンカの泳動先端部に反応した（図32）。し
かし・この反応は非特異的反応の可能性もあるので他のトビイロウン
カで再度確認する必要がある。このような小さいタンパク質はPAGEで
分離するのが難しいため、他の方法で発現を調べる必要がある。そこ
でRRSVの宿主に含まれているコムギの胚芽抽出液を用いて試験管内で
SlOのmRNAを翻訳したところ、　PlOminiとPlOは検出されなかった
　（図10）・PlOminiの分子量は1・3KDaと小さいことからPAGEでは検
出できないと考えた。そこでS10miniの途中から主要なORFに連続さ
せて約7KDaのタンパク質をコードするmRNAを作った。このmRNAでは
翻訳産物が検出されたのでSlOminiの開始コ．ドンは認識されている。
s10miniの存在は数回のウイルス継代後も確認されたので（結果は載
せなかった）、RRSVにはS10皿iniを保つ必要があると考えられる。
SlOminiのような小さいORFの場合、そこから発現するタンパク質が
機能するよりもその存在が下流のORFの発現を調節すると考えられる
（Kozak・1986）・RDVのS1では小さいORFの開始コドンをAAGに変え
たところ試験管内の翻訳、下流のPlの発現量が上昇した（Suzuki　et
al・・1992）・RRSVのSlOはS10miniの開始コドンが認識され、下流
のPlOが検出さなかった・これらのことから上流の小さいORFは下流の
145
…灘i灘灘醗i魑　・一 同碁灘欝。雛t灘’・　甕・駿、
主要なORFの発現を抑制するためにあると考えられる。しかし、　RDVの
P1とRRSVのPIOは罹病イネ及び保毒媒介昆虫で発現が確認されている
（図31）　（Suzuki　etal．，1994）．試験管内でmRNAの翻訳するに
はウサギ網状赤血球可溶化物あるいはコムギの胚芽抽出液を用いるが、
その条件は必ずしも生体内と同じではない。RRSVがイネに感染する、
あるいはトビイロウンカに保毒される機構の中でS10のmRNAが機能し
ていることを考慮する必要がある。
146
会椰 @　　　縣　　騨灘継購臨鑛帰憔騰欄稽L鎌，
V．総合論議
　RRSVではいままでに各セグメントの遺伝子産物が同定されていなかっ
た。本研究ではS6とS9がそれぞれ88KDaと35KDa（P9）の、また、　S8
が63KDaと50KDaの構造タンパク質をコードしていることを明らかに
した。更に、S10の主要なORFの翻訳産物が非構造タンパク質（P10）
であり、RRSV罹病イネと保毒トビイロウンカでその産物が検出できる
ことを示した。
　ウイルスの構造タンパク質は単にゲノムを保護するだけではなく、
感染において多くの役割を担っている。粒子表面の構造タンパク質は
ウイルスが細胞に侵入するのに関与していると考えられる。Reovirus
では粒子の外殻に存在するσ1タンパク質が宿主細胞の受容体と作用す
る（Lee　e亡a1．，1981）。RRSVでもトビイロ：ウンカに獲得される際
に粒子表面のタンパク質が受容体と作用することが予想される。P9と
50KDaのタンパク質は粒子表面に存在していることからその候補と考
えられる。P9が受容体と相互作用する可能性を調べるために、本研究
ではP9にアミノ酸置換を伴うSgU　RRSVとSgL　RRSVのトビイロウンカ
の棋風率を比較したが、違いは見られなかった。今後は更に、S9に変
異を持つRRSVを探索し、その性状を解析することで、　P9がトビイロウ
ンカのウイルス獲得に関与するかが明らかになると考えられる。また、
　　　　　　　　　　　　　　　147
難
・■駈福堰f，　　　　　？’「’鞭　’　‘／4搬鍮頴孕陶・輪∫＾・　・’菰蟹‘・…　　撫准’轍鮨　㈹　・
II］P””r
　
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薦
　
　
螺
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蕪
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蕪
　
　
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翻
RRSV粒子にはポリメラーゼ活性が認められている（Uyeda　e亡a1．，
1987）。レオウイルス科ウイルスのゲノムはdsRNAで、侵入直後に宿
主細胞でmRNAとしては働けない。従ってレオウイルス科ウイルスでは
ウイルス粒子自体にポリメラー・一・一・・ゼ活性があり、mRNAを合成することが
できる。更に、reovirusでは粒子成熟の最終段階で一鎖を合成するこ
とから一鎖合成の機構も粒子に存在する（Morgan　and　Zweerink，
1975）。RNAウイルスではRNA依存RNAポリメラーゼのアミノ酸配列モ
チーフからポリメラーゼの候補となるタンパク質が上げられている。
これまでに全塩基配列が報告されたRDV、　rotavirus、　reovirus、
bl　uetongue　virusでは一番長いセグメントがコ・…’一‘・ドしているタンパ
ク質が候補である（Suzuki　eta1．，1992）。これらの結果からRRSV
もSlがポリメラ・一’一”ゼをコードしている可能性が高いと考えられる。し
かし、一つのタンパク質だけがポリメラーゼの機能に関与していると
は限らない。Revirusの構造タンパク質の一つであるσ3（41KDa）は
mRNA合成の負の制御因子と考えられている（Astell　eta1．，
1972）．従ってSl以外にコードされている88KDa、63KDa、50KDaの
ような構造タンパク質がポリメラーゼの機能に関与している可能性も
ある。ホモロジー検索でタンパク質の機能を推定するためにS6とS8の
塩基配列を決定し、アミノ酸配列を明らかにする必要がある。一方、
PlOではアミノ酸配列の相同性からはその機能を推定することができ
なかった。伝搬性がなくなったRRSVの解析でSIOが伝搬性に関与する
　　　　　　　　　　　　　　　148
．鐵欝二＿
”揃嚢蟹　／t　　v”・’　　　　　　　　：；t＿za　Ea　L
蓬
懇
懇
馨
ことが示唆されたが（Maoka　e亡a1．，1993）、その翻訳産物のPlOの
機能は分かっていない。今後はRRSVが宿主細胞に侵入後、　PlOがどの
ように発現されるのかを詳しく調べる必要がある。また、RRSVの残り
セグメントに関しても塩基配列を決定し、遺伝子の翻訳産物を同定す
ることが必要である。
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149
．　諾・　“f：　　・’鵜・’　欄無猫1’・”・
VI．摘要
　ウイルス感染において遺伝子が果たす機能を解明するために、遺伝
子がコードするタンパク質を同定しなければならない。RRSVではS9と
S10の塩基配列が決定され、片方の鎖に長いORFが見つかった（Yan，
1992）．Sl－S8の塩基配列は決定されていないが、やはり長いORFが
あると考えられる。一方、RRSV粒子を構成する7種類のタンパク質
（構造タンパク質）はRRSVの遺伝子から発現すると考えられる。そこ
で本研究ではRRSVの各遺伝子が発現するタンパク質を同定することを
目的とし、各セグメントがコードするタンパク質と構造タンパク質の
関係を調べた。更に、S9の解析ではYan（1992）が見つけたSgLを、
SlOの解析では主要なORFとその上流の小さいORFの翻訳機構を調べた。
薄
μ
理
1．　Lee　e亡al．（1987）が作成した遺伝子ライブラリーはRRSVのゲ
　ノム全体を対象としていた。本研究ではハイブリダイゼーション
　によってS1－S8それぞれのクロ：一ンを同定した。
2． 　S1－S8それぞれにおいてcDNAの長い2－4クロ：一ンの制限酵素地図
を作成し、cDNA問の重複を調べた。また、各セグメントに対して
これらのクローンが含む割合を推定した。
　　　　　　　　　　　　　150
i鍵灘
3，　cDNAの一部を大腸菌発現用プラスミドベクター、　pMAL－c2ある
　いはpGEX－3Xに挿入してSl－S8がコードすると推定されるタンパク
　質の一部を発現させた。挿入したDNAの長さから推定した分子量よ
　　り約3－6KDa小さいものもあったが、　S4のcDNAを除いてほぼ推定し
　た分子量のタンパク質が発現した。抗RRSV粒子抗体を用いてウェ
　スタンブロッティングを行ったところ、S1、　S2、　S3、　S6、　S8由来
　のタンパク質が反応した。
4，　発現タンパク質に対する抗体を作成してウェスタンブロッティ
　ングを行ったところ、S6由来のcDNAの発現タンパク質に対する抗
　体とRRSVの88KDaの構造タンパク質が反応した。また、　S8由来の
　cDNAの発現タンパク質に対する抗体は63KDaと50KDaの構造タン
　パク質に反応した。
5． 　RRSVのゲノムのPAGEによってフィリピンのRRSV（RRSV－P）に
加え、タイのRRSV（RRSV－T）もSgLであることが判明した。更に、
RRSV－Pと北大のRRSV（RRSV－H）のSgLの塩基配列を決定し、　SgU
に対する塩基置換を検出した。
6．　843番目の塩基が異なるRRSVのS9を合成してPAGEで比較し、ア
　　　　　　　　　　　　　　　151
ktLt・’et：蔓蘇黙・嚇竈’‘　　　’灘’ヒ建ss ．’ 黶@　寒躍　．・
．．興襲許tt
デニンの場合はSgU、シトシンの場合はSgLであることを明らかに
した。
7，　微量のゲノム試料のSgUとSgLを検定できるSSCPを確立した。
　SgU　RRSVとSgL　RRSVの混合感染イネからトビイロ：ウンカが保毒
　したRRSVのS9をSSCPで調べたところ、　SgUのみ、あるいはSgLの
　み、あるいはそれら両方が検出されるトビイロウンカ個体があっ
　た。また、伝搬後のイネを調べた結果も同様だった
8，　S9がコー・一・一・ドするORFのcDNAを大腸菌発現用プラスミドベク
　タ・一・一・・、pMAL－c2に挿入してMBP－P9を発現させ、抗体を作成した。
　発現させたP9はPAGEの移動度がRRSVの35KDaの構造タンパク質と
　同じだった。抗RRSV粒子抗体は発現したP9に反応し、隠蟹BP－P9抗
　体はRRSVの35KDaの構造タンパク質と反応した。
9．　SgU　RRSVとSgL　RRSV（RRSV－HとRRSV－P）の保冷率を比較し
　たが、大きな違いがなかった。
10，　S10の主要なORFのcDNAを大腸菌発現用プラスミドベクター、
　pMAL－c2に挿入してMBP－PIOを発現させ、抗体を作成した。　P10の
　PAGE上の移動度は一番小さい構造タンパク質のP9より早かった。
　　　　　　　　　　　　　　152
1111111111Ji，N
抗MBP－PIO抗体はRRSVの構造タンパク質に反応せず、罹病イネと
保毒トビイロウンカの約34KDaのタンパク質に反応した。
ll．　SlOのSlOminiのcDNAを大腸菌発現用プラスミドベクター一”一’　N
　pGEX－3Xに挿入してGST－PlOminiを発現させ、抗体を作成した。
　抗GST－P10mini抗体は保毒トビイロウンカの泳動先端部に反応し
　た。
12，　S10のmRNAを用いてコムギの胚芽抽出液の試験管内翻訳を行っ
　たところ、翻訳産物は検出されなかった。PAGEでは1．3KDaの
　PlOminiは検出できないため、　S10miniの途中から主要なORFに連
　続させたmRNAを作成して試験管内翻訳を行ったところ、翻訳産物
　が検出された。
以上の結果からRRSVのS6とS9がそれぞれ88KDaと35KDa（P9）の、ま
た、S8が63KDaと50KDaの構造タンパク質をコードしていることが明
らかになった。更に、SgLの解析によって843番目の一塩基置換がS9の
移動度を変えていたことを明らかにした。SlOの解析では主要なORFの
翻訳産物が非構造タンパク質（PlO）であり、RRSV罹病イネと保毒ト
ビイロウンカで発現していることを明らかにすると共に、上流の小さ
いORFの開始コドンが機能している可能性を示した。
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Uyeda，　1．，　Lee，　S，　Y．，　Leng，　G．　W，，　Ao，　G，　M．，　Deng，　Z．　P．，　L　iang，　X，　S．，
Ohshima，　K，　and　Shikata，　E，　（1990b）．　Size　of　dsRNA　genome　segments　of　rice
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Uyeda，　1，，　Lee，　S．　Y．，　Yoshimoto，　H，　and　Shikata，　E．　（1987）．　RNA　polymerase
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Uyeda，　1，　and　Milne，　R．，　G．　（1995）．　Introduction：　Genomic　organization，
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　161
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　　　　　　　　　　　　　　　　　diversity　and　evolution　of　pla皿t　reoviruses．　∫θm加．　Virol．6（2）：　85－88，
　　　　　　　　　　　　　　　　　Uyeda，　1．，　Murao，　K，，　Ando，　Y．，　Suga，　H．　and　Kimura，　1．　（1995a）．　Variation
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　　　　　　　　　　　　　　　　　Uyeda，　1，，　Suda，　N．，　Yamada，　N．，　Kudo，　H．，　Suga，　H．，　K　imura，　1．，　Shikata，
　　　　　　　　　　　　　　　　　E，，　Kitagawa，　Y，，　Kusano，　T．，　Sugawara，　M．　and　Suzuki，　N．　（1994）．
　　　　　　　　　　　　　　　　　Nucleotide　sequence　of　rice　dwarf　Phytoreovirus　genome　segment　2：
　　　　　　　　　　　　　　　　　Completion　ef　sequence　analyses　of　rice　dwarf　virus，　intervirology　37：　6－11，
　　　　　　　　　　　　　　　　　Uyeda，　1．，　Suga，　H，，　Lee，　S，　Y．，　Yan，　J．，　Hataya，　T．，　Kimura，　1，　and
　　　　　　　　　　　　　　　　　Shikata，　E，　（1995b），　R　i　ce　ragged　stunt　Oryzavirus　genome　segment　9　encodes
　　　　　　　　　　　　　　　　　a　38600　Mr　structural　protein，　／．　Gen．　ViroL　76：　975－978．
　　　　　　　　　　　　　　　　　Wu，　H，　and　Crothers，　D，　M，　（1984），　The　locus　of　sequence－directed　and
　　　　　　　　　　　　　　　　　protein－induced　DNA　bending，　Nature　（Lond．）　308：　509－513．
　　　　　　　　　　　　　　　　　Xu，　Z，，　Anzola，　J　V．，　Nalin，　C，　M，　and　Nuss，　D．　L，　（1989）．　The　3’一terminal
　　　　　　　　　　　　　　　　　sequence　of　a　wound　tumor　virus　transcript　can　inf　luence　conformational　and
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　　　　　　　　　　　　　　　　　522，
　　　　　　　　　　　　　　　　　Yan，　J．　（1992），　Studies　on　genome　structure　of　rice　ragged　stunt　virus．
　　　　　　　　　　　　　　　　　Doc　torial　thesis　of　Hokkaido　University　（Faculty　of　agriculture）．
　　　　　　　　　　　　　　　　　Yan，　J，，　Kudo，　H，，　Uyeda，　1．，　Lee，　S．　and　Sh　i　kata，　E．　（1992）．　Conserved
　　　　　　　　　　　　　　　　　terminal　sequences　of　rice　ragged　stunt　virus　genomic　RNA，　」．　Gen．　ViroL　73：
　　　　　　　　　　　　　　　　　785－789，
　　　　　　　　　　　　　　　　　Yan，　J．，　Suga，　H．，　Uyeda，　1．，　Lee，　S．，　K　imura，　1．　and　Sh　ikata，　E．　（1995），
　　　　　　　　　　　　　　　　　Molecular　cloning　and　complete　nucleotide　sequence　of　rice　ragged　stunt
　　　　　　　　　　　　　　　　　Oryzavirus　genome　segment　10，　Ann．　Phytopa　th　oL　Soc．　Jpn．　61（3＞：　189－193．
　　　　　　　　　　　　　　　　　Yan，　J．，　Uyeda，　1り　　Kimura，　1．，　Shikata，　E，，　Chen，　C。　and（〕hen，　M，　（1994），
　　　　　　　　　　　　　　　　　Echinochloa　ragged　stunt　virus　belongs　to　the　same　genus　as　rice　ragged
　　　　　　　　　　　　　　　　　stunt　virus，　Ann．　PhytopathoL　Soc．　Jpn．　60　（5）：　613－616．
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　162
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Yokoyama，　M．，　Nozu，　Y．，　Hashimoto，　J，　and　Omura，　T．　（1984）．　In　vitro
transcription　by　RNA　pelymerase　associated　with　rice　gall　dwarf　virus，　」．
Gen．　ViroL　65：　533－538，
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　　　　　　　　　　付録｛略語と試薬類｝
1．イネラギッドスタントウイルスゲノムの研究に関する略語と名称
　ORF：読み取り枠
　P9：セグメント9の読み取り枠がコードするタンパク質
　PIO：セグメント10の主要な読み取り枠がコードするタンパク質
　PlOmini：S10の主要な読み取り枠の上流の小さい読み取り枠がコー
　　　　　ドするタンパク質
　pRR：pBR322のPst　1部位にRRSVのゲノムのcDNAを挿入したプラ
　　　　スミド
　RRSV：イネラギッドスタントウイルス
　RRSV　一一　H：北海道大学で継代されていたイネラギッドスタントウイ
　　　　ルス
　RRSV－P：フィリピンで継代されていたイネラギッドスタントウイ
　　　　ルス
　RRSV－T：タイで継代されていたイネラギッドスタントウイルス
　S：セグメント
　SgU：ポリアクリルアミドゲル電気泳動で認められる移動度の異な
　　　　るセグメント9のうち、移動度の遅い方
　SgL：ポリアクリルアミドゲル電気泳動で認められる移動度の異な
　　　　　　　　　　　　　　　164
　　　るセグメント9のうち、移動度の早い方
S10mini：SlOの主要な読み取り枠の上流の小さい読み取り枠
2．試薬類と実験上の略語
APS：Ammonium　peroxodisulfate
BSA：Bovine　serum　albumin
lOO×DenhardIs　solution：Ficoll　lOgと
　　　Polyvinylpyrolidone　lOgとBSA　10gを滅菌水で溶解
　　　して500mlとしたもの
DTT：Dithiothreitel
DMSO：Dimethy1　sulfoxide
5mM　dNTP：dATP、　dTTP、　dCTP、　dGTPが各5mMの混合液
泳動用色素：6×濃度保存液（0．25％Bromophenol　blue、0．25％
　　　Xylene　cyanol、30％グリセロ　一一ル）を試料と混合して
　　　1×にして使用
EDTA：Ethylenediaminetetraacetic　acid．　disodium　salt
ELISA：Enzyme－linked　immunosobent　assay
EtBr：エチジウムプロ：マイド
フェノール：固体フェノー一一一・ルをTEに溶解して飽和させ、　Trisで
　　　pH7．6に調整したもの
GST：グルタチオンーS一トランスフェラーゼ
　　　　　　　　　　　　　165
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IPTG：イソプロピルーβ一D一チオーガラクトシド
クロロホルム：ク打飯：ホルムとイソアミルアルコ…一”，ルを24：1
　　　（V：V）で混合したもの
LacZα：LacZ遺伝子産物のαペプチド
MBP：マルト・・一・一・・ス結合タンパク質
ナイロンメンブレン：アマシャム社製のHybond　N＋を使用
5mM　NTP：ATP、　UTP、　CTP、　GTPが各5mMの混合液
滅菌水：ミリポアプィルターを通過させた水（MilliQ水）をオー
　　　トクレープで滅菌したもの
PAGE：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PCR：Polymerase　chain　reaction
30％ポリアクリルアミドゲル保存溶液：アクリルアミド30gとビ
　　　スアクリルアミド0．8gを滅菌水で100皿1としたもの
40％ポリアクリルアミドゲル保存溶液：アクリルアミド38gとビ
　　　スアクリルアミド2gを滅菌水で100m1としたもの
Polyvinylidene　difluoride（PVDF）メンブレン：Millipor社
　　　製の　ImmobilonTM（Pore　size：0，45μm）を使用
SSC緩衝液：20×濃度保存溶液（3M塩化ナトリウム、0．3Mクエ
　　　ン酸ナトリウム）を必要に応じた濃度に希釈して使用
5M酢酸カリウム溶液（アルカリ法）：5M酢酸カリウム溶液60ml
　　　に酢酸11，5mlと滅菌水28．5mlを加えたもの
SDS：Sodium　lauryl　sulfate
166
羅薯騨，
SSCP：一本鎖多型分析
STE溶液：10×濃度保存液｛100mM　Tris－HC1（pH6．8）、IM塩
　　　化ナトリウム、10mM　EDTA｝を必要に応じて希釈して使用
TE：10mM　Tris－HCI（PH8，0）、lmM　EDTA（pH8，0）溶液
TEMED：N，　N，　N’，N’一tetramethylethylenediamine
Tris－HC1：HCIでpHを調整したTris（hydroxymethyl）
　　　aminomethane溶液
TBE緩衝液：10×濃度保存溶液｛0，5M　Tris、0．5Mほう酸、10mM
　　　EDTA（pH8，3）｝を必要に応じた濃度に希釈して使用
3，基本的実験操作
核酸をフェノール・クロロフォルムで抽出する：試料液に等量のフエ
　　　ノ…一一…ル・クロロフォルム液（フェノールとクロロフォルム
　　　を1：1で混合した溶液）を加えs室温で数分間混合後、卓上
　　　遠心分離機で12，000から14，000rpmで2分間以上遠心分離
　　　し、上層を移しとる操作
エタノール沈殿：核酸試料水溶液に1／10量の3M酢酸ナトリウム
　　　（pH5．2）と2．5倍量のエタノールを混合し、一30℃で一晩、
　　　あるいは一80℃で30分以上静置後、卓上遠心分離機で
　　　14，000rpm（4℃）で10分間以上遠心分離して（容量が多い
　　　場合はそれに相当する遠心分離機を使用して）核酸を沈殿
167
させる操作を示す。上清を除いた沈澱には上清と等量の冷
80％エタノーールを沈澱の逆側からゆっくり注ぎ入れて再度
同様に5分間以上遠心分離して塩を除き、沈殿をエヴァボレー
タ・一・一一・で（約5分間）乾燥させる操作
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