|
|
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers >
Theses >
博士 （歯学） >
アデノウイルスの増殖にはARE-mRNAの安定化システムが必要である
|
Files in This Item:
|
|
|
Related Items in HUSCAP:
|
| Title: | アデノウイルスの増殖にはARE-mRNAの安定化システムが必要である |
| Other Titles: | ARE-mRNA stabilization system is necessary to replicate adenovirus |
| Authors: | 鄭, 朱蒙 パトリック Browse this author |
| Keywords: | Adenovirus | | E4orf6 | | HUR | | ARE-mRNA stability |
| Issue Date: | 24-Mar-2016 |
| Publisher: | Hokkaido University |
| Abstract: | AU-rich element （ARE）はがん遺伝子など, 主に細胞増殖にかかわる多くの遺伝子の mRNA に含まれている遺伝子領域で, RNA 結合タンパク HUR が AREに特異的に結合することによって ARE-mRNA を核外輸送・安定化することが知られている. アデノウイルスの初期遺伝子タンパク E4orf6 による細胞がん化には, ARE-mRNA の恒常的な核外輸送・安定化が必須であることが解明されている. しかしながら, このシステムとアデノウイルスの増殖にどのような関連が存在するかはいまだ不明である. 本研究ではアデノウイルスが ARE-mRNAとそれに結合する HUR タンパクのウイルス増殖に及ぼす影響について検討した.
Tet-off システムを導入した HeLa 細胞に, FOS 遺伝子の ARE 領域を持つルシフェラーゼ遺伝子（LUC-ARE）を導入し, アデノウイルス感染後, doxycycline処理をして LUC-ARE の発現を停止させ, 継時的に LUC-ARE mRNA を定量しその半減期を決定した. また, 各種アデノウイルスの初期遺伝子を導入し,
ARE-mRNA 量の変化をリアルタイム RT-PCR 法で解析した. さらに RNAi 法によってHURをknockdownした細胞を用いてアデノウイルスの増殖効率を検討した. さらに, アデノウイルスによる E3 ユビキチンリガーゼ活性が ARE-mRNA3安定化に関与しているかについて検討した.
LUC-ARE 導入細胞にアデノウイルスを感染させると, LUC-ARE の半減期が延長され, 感染細胞では ARE を持つ mRNA が安定化された. さらに, ウイルス感染初期よりも, 後期の方がより安定化された. ウイルス遺伝子が欠損した変異型アデノウイルスの感染実験より, この安定化には E4 領域より翻訳されるE4orf3およびE4orf6タンパクが関与することが明らかになり, この結果は各遺伝子を細胞に導入した実験系でも確認できた. さらに, HUR をknockdown させたがん細胞にアデノウイルスを感染させると, ウイルス力価が1/3 に減少した. また, プロテアソーム阻害剤を処理した実験により,ARE-mRNA の安定化と, ユビキチンプロテアソーム系の経路は別であることが明らかになった.
これらの結果は, アデノウイルスの増殖には HUR を含む ARE-mRNA の安定化システムが重要であることを示している. | | AU-rich element (ARE) is RNA element, which is a target for rapid degradation of ARE containing mRNA. ARE is present in the 3′-untranslated regions of certain mRNA transcribed from growth-related genes. Several RNA binding proteins are known to interact with ARE and modulate the fate of ARE-mRNA. HUR, which is a member of the embryonic lethal abnormal vision (ELAV) family, binds to ARE in order to export and stabilize ARE-mRNA, when cells are under certain conditions such as heat shock or serum stimulation. Although the stabilization of ARE-mRNA is required for oncogenic activity mediated by E4orf6, one of the oncogene products of adenovirus, there is no evidence about the effect of the stabilization for adenovirus replication. In this study, I examined the correlation between ARE-mRNA stabilization and adenovirus replication. Luciferase and ARE fusion gene (LUC-ARE) was introduced into HeLa cells including tet-off system to examine the stabilization of the fusion gene in adenovirus infected cells. In order to estimate the half-life of the fusion gene, the quantity of the mRNA was detected using real-time RT-PCR after stopping the transcription of LUC-ARE mRNA by adding doxycyclin. The half –life of the fusion mRNA in adenovirus infected cells was longer in the late time of the infection than that of 31 non-infected cells. I determined that adenovirus E4orf3 and E4orf6 were required for this stabilization by using mutant adenoviruses. Furthermore, adenovirus production was inhibited when ARE-mRNA stabilization system was disrupted by HUR knockdown, indicating that this system is necessary to adenovirus replication. Adenovirus E4orf6/E1B55kD complex is known to activate E3 ubiquitin ligase. To investigate whether the viral E3 ubiquitin ligase is required for the system of ARE-mRNA stabilization, adenovirus infected cells were treated with proteasome inhibitor MG132. There was no difference in the half-life of LUC-ARE mRNA, suggesting that ARE-mRNA stabilization and E3 ubiquitin ligase were independent with each other. These data indicate that adenovirus infection induce the stabilization system of ARE-mRNA, which is required for the virus replication. |
| Conffering University: | 北海道大学 |
| Degree Report Number: | 甲第12163号 |
| Degree Level: | 博士 |
| Degree Discipline: | 歯学 |
| Examination Committee Members: | (主査) 特任教授 進藤 正信, 教授 柴田 健一郎, 教授 田村 正人, 准教授 東野 史裕 |
| Degree Affiliation: | 歯学研究科（口腔医学専攻） |
| Type: | theses (doctoral) |
| URI: | http://hdl.handle.net/2115/67917 |
| Appears in Collections: | 学位論文 (Theses) > 博士 （歯学）
課程博士 (Doctorate by way of Advanced Course) > 歯学院(Graduate School of Dental Medicine)
|
|
