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The genetic bases of inter- and intrastrain differences in CYP2D-dependent drug metabolism in rats

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Please use this identifier to cite or link to this item:https://doi.org/10.14943/doctoral.k9042

Title: The genetic bases of inter- and intrastrain differences in CYP2D-dependent drug metabolism in rats
Other Titles: ラットにおけるCYP2Dの系統差及び個体差の分子機構の解明
Authors: Sakai, Noriaki1 Browse this author
Authors(alt): 酒井, 紀彰1
Issue Date: 25-Mar-2009
Publisher: Hokkaido University
Abstract: The rat is an important model for understanding human physiology and disease. The rat contributes to the biomedical researches of human cardiovascular disease, diabetes, arthritis and many behavioral disorders. In particular, the rat has frequently been used in the fields of pharmacology and toxicology. Thus, pharmaceutical companies use rats for a large proportion of their mandatory toxicity testing. However, inter- and intrastrain differences in drug response are often observed among rat strains, and are an important issue to be overcome. Still, the fundamental mechanism of inter- and intrastrain differences regarding drug metabolizing enzymes have been overlooked. In this thesis, I focused on the CYP2D subfamily that is a key enzyme involved in individual differences in drug metabolism. CYP2D2 enzyme is known to metabolize the majority of typical substrates of the human CYP2D6 enzyme. Despite its impact on drug metabolism in rats, the transcriptional regulation of CYP2D2 remained to be elucidated. In chapter 1, I clarified the molecular mechanism of CYP2D2 gene expression. The CYP2D2 gene was positively regulated by the poly(C)-binding protein hnRNP K through a transcriptional regulatory element located in the 5'-flanking region from -94 to -113. Acting as a docking platform, the hnRNP K protein is known to be implicated in the regulation of transcription as an activator or a repressor, as a translational repressor, and as a participant in a variety of signaling systems. Although it has only been reported that hnRNP A1 protein, one of the hnRNPs, involves in the stabilization of the CYP2A5 and CYP2A6 mRNA, nothing is known about the potential role of hnRNP K in P450 gene regulation. Thus, this is the first report that hnRNP K protein is involved in CYP2D2 gene regulation. Furthermore, I elucidated the genetic basis of the extremely low expression of CYP2D2 mRNA in DA rats. Due to its relative low abundance, DA rats have been frequently used for the study of CYP2D substrate metabolism as the animal model of PM phenotype for CYP2D6 in comparison to SD rats as an EM phenotype. To take full advantage of physiological variation among rat strains, it is essential to further unravel the mechanism of low expression of CYP2D2 mRNA. I found a single substitution within the transcriptional regulatory element of the CYP2D2 gene in DA rats. The mutation was detected in the polypyrimidine sequence that is the preferred binding site for hnRNP K protein. Indeed, the mutation within the transcriptional regulatory element abolished the binding of hnRNP K protein. Thus, I conclude that decreased recruitment of hnRNP K protein to the mutated sequence causes the low expression of CYP2D2 mRNA in DA rats. Inter- and intrastrain differences in drug response in rats are a difficult problem for basic research as well as drug discovery as described above. Currently, information on genetic variation in laboratory rat strains is rapidly accumulating as a set of microsatellite markers, simple sequence length polymorphism markers and a variety of single nucleotide polymorphism in coding regions. Nevertheless, little is known about the differences in their drug metabolism characteristics that are ascribed to genetic variation. In chapter 2, I clarified the mechanism underlying inter- and intrastrain differences in diazepam p-hydroxylation among rat strains. The recent studies demonstrated that the pharmacokinetics of diazepam, which is one of the benzodiazepines, were quite different among rat strains because of its metabolic polymorphisms in diazepam p-hydroxylation. Although diazepam p-hydroxylation is a major metabolic pathway, SD and BN rats had 300-fold higher diazepam p-hydroxylation activity than DA rats at low concentration of diazepam. And Wistar rats showed 200-fold intrastrain differences in diazepam p-hydroxylation activity (EM-W > PM-W). In addition, it was suggested that CYP2D subfamily was involved in this activity. Based on these observations, I separated the specific protein expressed in liver microsomes of SD, BN and EM-W, and identified the specific protein to be CYP2D3. Then, I confirmed that only CYP2D3 but no other CYP2D isoforms had a diazepam p-hydroxylation activity. To date, there is little information about the catalytic specificity of CYP2D3. Thus, I demonstrated that CYP2D3 was involved in diazepam p-hydroxylation. Moreover, I analyzed the genetic polymorphism of the CYP2D3 gene among rat strains. I found a single insertion in exon 8 in DA and PM-W rats. A premature termination codon created by this frameshift consequently deleted the heme-binding region that is essential to maintain proper heme binding and active P450 enzymes. Therefore, I conclude that the deficiency of a functional CYP2D3 protein must be the cause of the significantly low diazepam p-hydroxylation in DA and PM-W rats. Additionally, the genotype frequency of CYP2D3 polymorphism is in good agreement with the phenotype frequency among rat strains. In this thesis, I clarified the genetic bases of inter- and intrastrain differences in CYP2D-dependent drug metabolism in rats. Clarification of inter- and intrastrain differences in rats will be further useful for predicting variability in human pharmacokinetics. Consequently, it is worthwhile to fully characterize animals used in pharmacokinetics studies from the point of view of the genetic expression of metabolic enzymes. Therefore, my work will strongly support the strain consideration in selection of a rat strain for drug metabolisms.
シトクロムP450(CYP, P450)は、生理活性物質の合成や代謝だけでなく、医薬品や環境汚染物質などの外来異物の代謝にも関与する酵素群である。特にヒトCYP2D6は、医薬品の約30%を代謝するにも関わらず多くの遺伝多型が存在する事から、薬効の個人差や副作用の発現に深く関与している。このため、CYP2D分子種は、毒性学上、非常に重要な分子種として位置付けられている。そこで本研究では、CYP2D分子種依存の薬物代謝反応におけるラットの系統差及び個体差、そしてそれらを引き起こすメカニズムについて、明らかにする事を目的とした。第1章では、Dark Agouti(DA)ラットにおけるCYP2D2mRNA低発現機構を解明した。DAラットは、ヒトCYP2D6の典型的基質を代謝する能力が著しく低いため、ヒトCYP2D6の代謝欠損者の動物モデルとして用いられている。ヒトCYP2D6の典型的基質の多くは、ラットCYP2D2によって代謝され、特にDAラットでは、Sprague-Dawley(SD)ラットやWistar系ラットに比べ、CYP2D2 mRNA及び蛋白質発現量が低い事が、CYP2D分子種依存の代謝活性が低い原因であると報告されている。しかし、DAラットにおいて、CYP2D2 mRNA発現量が低下している原因については、未だ明らかにされていない。そこで、CYP2D2遺伝子の5’上流域を、4kbにわたりシークエンス解析を行ったところ、DAラットにおいてTATAボックスの近傍にシトシンからチミンへの一塩基置換がある事を見出した。一方、SDラットでは同領域に変異は認められなかった。次にElectrophoresis mobility shift assayから、DAラットにおいて検出された一塩基置換は、核蛋白質(転写因子)/DNA複合体の形成を低下させる事が確認された。また、CYP2D2遺伝子のプロモーター領域の各種欠失変異体を用いたレポーターアッセイの結果、この一塩基置換により転写活性は約1/4に低下した。さらに、Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometryを用いて、CYP2D2遺伝子発現に関与する転写因子の同定を試みた。その結果、転写装置の足場蛋白として働く多機能な核蛋白質として知られる、ヘテロ核内リボ核蛋白質 K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K: hnRNP K)が、コアプロモーター領域に結合する事を明らかにした。よって、DAラットにおけるCYP2D2mRNAの低発現は、CYP2D2遺伝子のプロモーター領域内の一塩基置換により、hnRNP K蛋白質のDNA結合が低下する事が原因である事を初めて明らかにした。第2章では、ジアゼパム代謝における系統差及び個体差発現機構を解明した。抗不安薬として世界で広く使用されているジアゼパムには、3位水酸化、N脱メチル化、p位水酸化の3つの代謝経路が存在する。これまでの研究から、低基質濃度ではジアゼパムp位水酸化が、ラットにおける主要な代謝経路であり、かつ著しい系統差(約300倍)及び個体差(約200倍)を示す事が報告されている。さらに、抗体を用いた阻害実験から、CYP2D分子種がこの代謝反応に関与する事が示唆されたが、CYP2D2の発現量の差では説明できない事が報告されており、未だその代謝酵素の同定には至っていない。そこで、ウエスタンブロット法を用いて、高活性個体のみに特異的に発現する蛋白質を単離した。アミノ酸シークエンスによってN末端配列を決定したところ、今まで主な触媒反応がわかっていない、CYP2D3のアミノ酸配列と完全に一致した。酵母に発現させたCYP2D3は、ジアゼパムp位水酸化活性を示したが、CYP2D2にはその活性がない事も再構成系実験を用いて確認した。さらに、定量リアルタイムPCR法により、CYP2D3 mRNA量を測定した。ところが、系統間及び個体間で、p位水酸化活性と相関のある発現量の差は認められなかった。そこで、CYP2D3のcDNAシークエンスを調べた。低活性個体では、一塩基挿入によるフレームシフトが認められ、P450の活性中心であるヘム結合領域の上流に終止コドンが形成されていた。このため、p位水酸化の低活性個体では、代謝機能を失った蛋白質が合成される事が予想された。したがって、CYP2D3の翻訳領域内の一塩基挿入により、機能的なCYP2D3をコードするmRNAの発現が低下する事で、ジアゼパムp位水酸化の系統差及び個体差が引き起こされる事を初めて明らかにした。以上の結果から、CYP2D分子種依存の薬物代謝反応における、ラットの系統差及び個体差発現の分子機構を明らかにした。ラットは、特に薬物代謝研究において多用されているにも関わらず、薬物代謝酵素に関する系統間及び個体間での遺伝的背景については、これまで明らかにされていなかった。また、CYP2D分子種は医薬品に対する感受性を決定する、最も重要な分子種の一つである事から、本研究成果は、薬物代謝研究におけるラットの系統を選択する際に、非常に有用な指標を与えるものと考えられる。
Conffering University: 北海道大学
Degree Report Number: 甲第9042号
Degree Level: 博士
Degree Discipline: 獣医学
Type: theses (doctoral)
URI: http://hdl.handle.net/2115/39716
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Submitter: 酒井 紀彰

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