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デスレセプターを介するアポトーシス誘導に重要な 新規分子DELEの同定とその機能解析

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この文献には次のDOIがあります:http://doi.org/10.14943/doctoral.k9705

タイトル: デスレセプターを介するアポトーシス誘導に重要な 新規分子DELEの同定とその機能解析
その他のタイトル: Identification of DELE, a novel DAP3-binding protein which is crucial for death receptor-mediated apoptosis induction
著者: 原田, 種展 著作を一覧する
発行日: 2010年 9月24日
抄録: Apoptosis is known as a form of programmed cell death, essential for the organogenesis of individuals, maintenance of the immune system, and elimination of injured cells and tumor cells. In cases when the regulatory mechanism of apoptosis becomes imbalanced, it induces severe diseases; for example, tumor development, breakdown of the immune system or neurodegeneration.Members of the death receptor (DR) family including tumor necrosis factor (TNF) receptor type1, Fas, DR3, TNF-related apoptosis inducing ligand receptors (TRAILR1/DR4 and TRAILR2/DR5) and DR6 are responsible to transduce apoptosis signal. These receptors are important for the regulation of many physiological and pathological events related to several human diseases. DR member family molecules induce apoptosis by the trimerization and aggregation of DR molecules on the plasma membrane. This receptor aggregation leads to recruitment of several subcellular proteins such as Fas-associated death domain protein (FADD) to the cytoplasmic domain of these receptors. The recruitment of FADD to DR is mediated through each death domain (DD) of DR to induce activation of caspases, cysteine proteases resulting in apoptosis induction.Death associated protein 3 (DAP3) is a GTP binding protein originally identified as a molecule which is responsible for activating interferon γ-induced apoptosis, and it has been reported that DAP3 is also important as a signal transducer for apoptosis induced by DR stimulation. In TRAIL induced apoptosis, DAP3 binds to TRAIL receptors, DR4 and DR5, and forms a complex with caspase-8 through FADD to activate caspase-8 depending on the stimulation of TRAIL. Thus, DAP3 is functional in cytoplasm for activation of TRAIL-mediated signaling pathway immediately downstream of DR4 and DR5. On the other hand, DAP3 is also observed abundantly in mitochondria, and the deletion mutant of DAP3 which lacks N-terminal region containing mitochondrial localization signal is not able to activate an apoptosis induced by the stimulation of FasL and TNF-α. These observations suggest that the mitochondrial localized DAP3 is also responsible for induction of apoptosis. However, molecular mechanisms of mitochondrial DAP3 for induction of apoptosis are poorly understood.From this point of view, initially, the mitochondrial localized proteins were selected by using the prediction program of subcellular localization (PSORT II; http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) from positive clones obtained by yeast two-hybrid screening, previously performed in our laboratory to identify DAP3-binding proteins. The results showed that the subcellular localization of one of the positive clones which encoded a functionally unknown protein was predicted to be localized in mitochondria. Consequently, focused on this clone designated as DELE (death ligand signal enhancer), the molecular functions of DELE were analyzed. The DELE protein is a 55 kDa protein consists of 515 amino acids, and found to contain a mitochondrial targeting sequence at the N-terminus, two tetratrico peptide repeat (TPR) motifs. In this study, the molecular functions of DELE on the apoptosis induced by the stimulation of TNF-α, FasL and TRAIL were characterized. The co-immunoprecipitation analysis revealed that DELE actually binds to DAP3 in mammalian cells. The subcellular localization of DELE was analyzed by confocal laser scanning microscopy. The result shows that the subcellular localization of DELE is mainly observed in mitochondria, as was predicted by the analysis using PSORT II. The A549 cell lines in which the DELE gene is stably expressed were found to become susceptible to the apoptosis induction by the stimulation of TNF-α, anti-Fas, and TRAIL. In addition, knockdown of DELE gene expression by siRNA treatment significantly protected the HeLa cells from the apoptosis induction by the stimulation of these cytokines. Moreover, activation of caspase-3, -8, and caspase-9 by these stimulations was significantly suppressed by the knockdown of DELE gene expression.In conclusion, this study demonstrated that the newly identified DELE regulates the death receptor-mediated apoptosis through the regulation of caspase activity.
Death associated protein 3 (DAP3)は、Interferon-γ (IFN-γ)によって誘導されるアポトーシスに関与する分子として同定されたGTP会合タンパク質である。その後の研究により、TNF-α (tumor necrosis factor-α)、FasL (Fas ligand)およびTRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand)刺激によるデスレセプターを介したアポトーシスシグナル伝達経路をはじめ、酸化ストレスによって誘導されるアポトーシスや、足場喪失に伴い誘導されるアポトーシスとして知られるアノイキスなど様々なアポトーシスの制御に重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。本研究ではDAP3と会合するその機能が未知である分子、DELE (death ligand signal enhancer)の機能を明らかとすることを目的とし、分子生物学的手法を用いた解析を行った。DELEは酵母two-hybrid法を用いたスクリーニングによりDAP3 と会合する分子として筆者が所属する研究室で見出された分子である。DELEは515アミノ酸からなる分子量約55kDaのタンパク質であり、アミノ酸配列の解析により、そのN末端領域にミトコンドリア局在シグナル配列を有すること、また機能ドメインとしてタンパク質相互の結合に関与するモチーフであるTPR (tetra-tricopeptide repeat)モチーフ を有することが明らかとなった。DELE遺伝子の発現ベクターを構築し、これを細胞に発現させて免疫共沈降法による解析を行った結果、DELEとDAP3は実際に哺乳動物細胞内で会合していた。次に、DELEとEGFP (enhanced green fluorescent protein)を融合させたタンパク質 (DELE-EGFP) を発現するベクタープラスミドを構築し、細胞に発現させて共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内局在の解析を行ったところ、DELEの局在は主にミトコンドリアに認められ、DAP3と同様の細胞内局在分布を示すことが明らかとなった。これらの結果から、DELEはDAP3の関与するアポトーシスシグナル伝達経路に関与している可能性が強く示唆された。そこでDELEの分子機能を明らかとするために、デスレセプターを介したシグナル伝達機構に注目して以下の解析を行った。レトロウイルスベクターを用いて、DELE遺伝子を恒常的に高発現するA549細胞由来の培養細胞株を樹立し、TNF-αおよびTRAIL刺激により誘導されるアポトーシスへの感受性について解析した。その結果、DELE遺伝子を恒常的に高発現する細胞はコントロール細胞と比較して、TNF-αおよびTRAIL刺激によって誘導されるアポトーシスに対し、高い感受性を示すことが明らかとなった。さらに、siRNAを用いて、DELE遺伝子の発現を抑制したHeLa細胞に、TNF-αおよびTRAILの刺激を加え、DELE遺伝子の発現がこれらの刺激により誘導されるアポトーシスに対する感受性に影響を及ぼすか否かについて解析した。その結果、DELE遺伝子の発現を抑制した細胞ではコントロール細胞と比較して、TNF-αおよびTRAILの刺激によって誘導されるアポトーシスが有意に抑制されることが明らかとなった。カスパーゼの開裂による活性化は、デスレセプターを介したシグナル伝達経路によって制御されるアポトーシスをはじめ、様々なアポトーシスにおいてその誘導に重要な現象であることが知られている。そこで、DELEがカスパーゼ依存的なアポトーシスシグナル伝達経路に関与している可能性を検証した。siRNAを用いてDELE遺伝子の発現を抑制したHeLa細胞に対し、TNF-αおよびTRAILの刺激を加え、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9およびカスパーゼ-3開裂の経時的変化を、カスパーゼに対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した。その結果、DELE遺伝子の発現を抑制した細胞では、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9およびカスパーゼ-3のいずれにおいても、その開裂が抑制されることが明らかとなった。また、DELE遺伝子の発現抑制によって、実際にカスパーゼの活性化が阻害されるか否かを調べるために、TNF-α、抗Fas抗体およびTRAILの刺激によって誘導されるカスパーゼの活性化をCaspase-Glo Assay Kit (Promega)を用いて定量的に解析した。その結果、DELE遺伝子の発現を抑制したHeLa細胞では、TNF-α、抗Fas抗体およびTRAILのいずれによる刺激においても、カスパーゼの活性化が阻害されることが明らかとなった。これらの結果より、DELEはカスパーゼ活性化の制御を通じてデスレセプターを介したアポトーシスの誘導に働くものと結論づけた。デスレセプターを介したアポトーシスシグナル伝達経路の異常はがんや自己免疫疾患をはじめ、様々な疾患の発症に関わることが知られており、本研究で見出された新規分子DELEの発現や機能の異常がこれら疾患の発症に関与している可能性が考えられる。
学位授与機関: Hokkaido University(北海道大学)
学位の報告番号: 甲第9705号
取得学位の種別: 博士
取得学位の分野: 獣医学
資料タイプ: theses (doctoral)
URI: http://hdl.handle.net/2115/43931
出現コレクション:博士 (獣医学)

提供者: 原田 種展

 

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