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Studies on MHC class I-mediated entry of equine herpesvirus-1 into cells

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Title: Studies on MHC class I-mediated entry of equine herpesvirus-1 into cells
Other Titles: MHC class Iを介したウマヘルペスウィルスI型の細胞内侵入機構の解析
Authors: Sasaki, Michihito1 Browse this author
Authors(alt): 佐々木, 道仁1
Issue Date: 24-Mar-2011
Abstract: Equine herpesvirus 1 (EHV-1) is an endemic virus that affects horse populations worldwide, causing respiratory disease, abortion and a serious neurologic disease known as encephalomyelitis. Outbreaks of EHV-1 encephalomyelitis can have a severe economic impact on farms, racetracks and veterinary hospitals, and currently available vaccines are not effective to protect against EHV-1 encephalomyelitis. Histological analyses of affected horses indicate that viral infection of vascular endothelial cells leads to damage of the central nervous system due to the resulting shortage of blood supply. Although infection of these cells is closely associated with the development of encephalomyelitis, the molecular mechanisms underlying this association remain poorly understood.Alphaherpesviruses enter target cells through sequential multistep processes. Following the initial attachment of the viruses to the cell surface, binding of viral glycoproteins to cell surface receptors triggers fusion of the viral envelope with the cell membrane, resulting in the release of viral capsid (containing viral genome) into the cytoplasm. EHV-1 attaches to cell surface using an interaction between viral glycoprotein C (gC) and cell surface heparan sulfate. Although the role of gC is important for effective infection, it does not trigger viral entry into cells. Glycoprotein D (gD) of EHV-1 is known to be essential for EHV-1 entry into cells. However, functional gD receptor that mediates EHV-1 entry into equine central nervous system (CNS) endothelial cells remains unidentified.In chapter 1, I performed functional cloning using an equine brain microvascular endothelial cell cDNA library and identified that equine major histocompatibility complex (MHC) class I heavy chain conferred susceptibility to EHV-1 infection in mouse NIH3T3 cells, which are resistant to EHV-1 infection. I investigated the role of equine MHC class I in EHV-1 infection and revealed that equine MHC class I acts as an entry receptor for EHV-1 through its binding to EHV-1 gD. I further investigated the role of MHC class I in EHV-1 entry into different types of equine cells.In chapter 2, I constructed equine MHC class I heavy chain specific-RNA probe and performed Northern hybridization to examine the level of equine MHC class I gene expression in the major organs of the adult horse body. The localization of equine MHC class I mRNA in brain tissue was investigated by in situ hybridization.In this thesis, I demonstrated equine MHC class I is a bona fide receptor of EHV-1 entry into equine cells. This study provides new insights into the mechanism of EHV-1 entry into host cells and a potential way to treat and prevent this infectious disease.
ウマヘルペスウイルス1型 (EHV-1) はヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科に属し、馬に脳脊髄炎、流産、鼻肺炎を惹き起こす。罹患馬に重篤な神経症状をもたらす脳脊髄炎では、中枢神経系の血管内皮細胞へのウイルス感染が病態形成に大きな役割を果たすことが明らかになっている。しかしながら、EHV-1の血管内皮向性を規定する宿主因子に関しては不明な点が多い。第1章では、ウマ脳微小血管内皮細胞(EBMECs)より作製したcDNA発現ライブラリーを用いて、EHV-1レセプターのクローニングを試みた。スクリーニングの結果、EHV-1非感受性細胞であるマウス由来細胞株NIH3T3にEHV-1感受性を付与する遺伝子として、ウマ主要組織適合遺伝子複合体(MHC)class I重鎖遺伝子を同定した。ウマMHC class I重鎖遺伝子を安定発現させたNIH3T3細胞へのEHV-1感染は、抗MHC class Iモノクローナル抗体、抗EHV-1 glycoprotein D (gD) ポリクローナル抗体およびgDヒトイムノグロブリン(Ig)融合タンパク(gD-Ig)によって阻害された。また、gD-IgはウマMHC class I分子に特異的に結合した。これらの結果から、ウマMHC class IがEHV-1 gDをリガンドとするエントリーレセプターであることが明らかになった。次に、EHV-1の自然宿主である馬の細胞を用いて、EHV-1感染におけるウマMHC class I分子の関与を解析した。ウマ真皮由来株化細胞E. Derm、EBMECs、ウマ末梢血単核球(PBMC)を抗MHC class Iモノクローナル抗体で前処理すると、EHV-1感染は阻害された。また、β2ミクログロブリン(β2m)分子の発現のノックダウンによってMHC class I分子の細胞表面発現を抑制したE. Derm細胞は、EHV-1感受性が顕著に減少した。以上の結果から、ウマMHC class IはEHV-1のウマ細胞内侵入に重要な役割を果たすことが明らかになった。EHV-1は既知のアルファヘルペスウイルスレセプターを発現していないハムスター由来細胞株CHO-K1に感染し増殖する。そこで、EHV-1のCHO-K1細胞への侵入にハムスターMHC class I分子が関与しているかどうかを検討した。抗MHC class Iモノクローナル抗体の前処理によってEHV-1感染は阻害されなかった。また、β2m分子の発現のノックダウンによってCHO-K1細胞表面におけるMHC class I分子の発現を抑制しても、EHV-1感受性の変化は認められなかった。従って、CHO-K1細胞にはMHC class Iに依存しないEHV-1の細胞内侵入機構が存在することが示唆された。第2章では、ウマ組織におけるMHC class I遺伝子発現の局在を解析した。成馬の全身主要臓器をノーザンハイブリダイゼーションにより解析した結果、検索した全臓器においてウマMHC class I mRNAが検出された。また、成馬脳組織に対してin situハイブリダイゼーション法を施行したところ、ウマMHC class I mRNAの局在を示すシグナルは血管内皮細胞に限局しており、神経細胞を含むその他の細胞にシグナルは認められなかった。以上の結果より、馬の中枢神経系におけるMHC class Iの遺伝子発現はEHV-1の標的細胞である血管内皮細胞に限局しており、MHC class Iの遺伝子発現がEHV-1の脳脊髄炎の病態形成に関与している可能性が示唆された。ウイルスの細胞内侵入は、感染の成立に重要なステップである。本研究によって、ウマMHC class IがEHV-1のエントリーレセプターとして機能することが明らかとなり、これはEHV-1の細胞内侵入機構の解明において重要な知見であると考えられる。また、抗体や組換えタンパクを用いた感染実験の結果より、EHV-1 gDとMHC class Iの結合阻害が、EHV-1感染症の治療法として有用である可能性が示唆された。
Conffering University: 北海道大学
Degree Report Number: 甲第9952号
Degree Level: 博士
Degree Discipline: 獣医学
Type: theses (doctoral)
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Submitter: 佐々木 道仁

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