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Detailed assessment of gene activation levels by multiple hypoxia responsive elements under various hypoxic conditions [an abstract of entire text]
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| Title: | Detailed assessment of gene activation levels by multiple hypoxia responsive elements under various hypoxic conditions [an abstract of entire text] |
| Other Titles: | さまざまな低酸素条件における低酸素応答領域による遺伝子発現の評価 [全文の要約] |
| Authors: | 竹内, 康人 Browse this author |
| Keywords: | hypoxia responsive element (HRE) | | reporter genes | | tumor hypoxia | | molecular imaging | | gene therapy |
| Issue Date: | 25-Mar-2014 |
| Publisher: | Hokkaido University |
| Abstract: | Introduction: HIF-1/HRE pathway, which regulates various hypoxia-targeted genes, is a promising target for the imaging and the treatment of intractable malignancy (HIF-1; hypoxia inducible factor 1, HRE; hypoxia responsive elements). The purposes of our study are: (1) to assess the gene activation levels resulting from various numbers of HREs under various durations of hypoxia and hypoxic conditions, (2) to evaluate the bidirectional activity of multiple HREs in tandem, and (3) to confirm whether multiple HREs can induce gene expression in vivo in response to tumor hypoxia. Methods: We designed twelve constructs containing a firefly luciferase reporter gene and various numbers (2, 4, 6, 8, 10, and 12) of HREs(nHRE+, nHRE－). Human colon carcinoma HCT116 cells were transiently transfected and measured the relative luciferase activities by HREs under various durations of hypoxia (6, 12, 18, and 24 h), hypoxic O2 concentrations(1,2, 4, 8, and 16%), and hypoxia-like chemical stress using various concentration of deferoxamine mesylate (20, 40, 80, 160, and 320μg/mL growth medium). The bidirectional gene activation levels by HREs also examined in the constructs (dual-luc-nHREs) containing firefly and Renilla luciferase reporter genes at each side of various numbers (2, 4, 6, 8, 10, and 12). Finally, HCT116 cells were stably transfected with the reporter construct containing 12HRE and the NIS reporter gene (pGL4-12HRE-NIS). To test whether multiple HREs can induce gene expression in vivo in response to tumor hypoxia, SPECT imaging of tumor hypoxia was performed in a mouse subcutaneous xenograft model. Results: The new findings from this study are as follows: (1) gene activation levels by HREs tended to increase with increasing HRE copy number, but a saturation effect was observed in constructs with more than 6 or 8 copies of an HRE; (2) gene activation levels by HREs increased remarkably during 6–12 h of hypoxia, but not beyond 12 h; (3) gene activation levels by HREs decreased with increasing O2 concentrations, but could be detected even under mild hypoxia at 16% O2; (4) the bidirectionally proportional activity of the HRE was confirmed regardless of the hypoxic severity; and (5) NIS expression driven by 12 tandem copies of an HRE in response to hypoxia could be visualized in vivo SPECT imaging. Conclusion: The results of this study will help understanding and assessment of the activity of multiple HREs under hypoxia and become the basis for hypoxia-targeted imaging and therapy in the future. | | 【緒言】HIF‑1/HRE pathway(HIF‑1;低酸素誘導因子1、HRE;低酸素応答領域)は、さまざまな低酸素関連遺伝子を調節しており、イメージングや難治性癌に対する治療の有用な標的である。本研究は、１）さまざまな低酸素環境や負荷時間における複数のHREによる遺伝子発現を評価すること、２）HREの双方向への遺伝子発現を評価すること、３）腫瘍内の低酸素に応じてHREが遺伝子発現を誘導するかどうか確認することを目的とした。 【方法】ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子と複数のHRE（2,4,6,8,10,12個）を含むベクターを作製した。作製したベクターをヒト大腸癌細胞株HCT116に導入し、さまざまな低酸素負荷時間（6,12,18,24時間）、酸素濃度（1,2,4,8,16%）、DFOによる化学的な低酸素負荷（20,40,80,160,320μg/mL）における、HREによるシフェラーゼ発現を測定した。また、ホタルルシフェラーゼとウミシイタタケシフェラーゼレポーター遺伝子を持つベクターを用いて、HREの双方向への遺伝子発現を調べた。さらに、12HREとNISレポーター遺伝子をもつベクターをHCT16に安定導入し、腫瘍内の低酸素に応じてHREが遺伝子発現を誘導することを調べるために、皮下腫瘍マウスモデルを用いたSPECTイメージングを行なった。 【結果】以下の結果が本研究で得られた。（１）HREコピー数の増加に伴ってHREによる遺伝子発現は増加する傾向が見られたが、6‑8HRE以上のベクターでは増加の頭打ちが見られた。（２）低酸素負荷6時間から12時間にかけて、HREによる遺伝子発現は著明な増加が見られたが、12時間を超えた負荷時間では見られなかった。（３）酸素濃度の増加に伴ってHREによる遺伝子発現が低下した。16%という緩やかな低酸素においてもHREによる遺伝子発現が認められた。（４）低酸素の程度に関わらず、HREの双方向への遺伝子発現を認めた。（５）99mTcO4‑を用いたSPECTイメージングでは、腫瘍内の低酸素に応じた12HREによるNISの遺伝子発現が確認された。 【結果】本研究の結果は、低酸素下における複数のHREの遺伝子発現メカニズムの理解と評価に役立ち、将来的に、低酸素を標的としたイメージングや治療における基礎 となるであろう。 |
| Description: | この博士論文全文の閲覧方法については、以下のサイトをご参照ください。 |
| Description URI: | https://www.lib.hokudai.ac.jp/dissertations/copy-guides/ |
| Conffering University: | 北海道大学 |
| Degree Report Number: | 甲第11269号 |
| Degree Level: | 博士 |
| Degree Discipline: | 歯学 |
| Examination Committee Members: | (主査) 教授 北川 善政, 教授 進藤 正信, 教授 鄭 漢忠, 准教授 犬伏 正幸 （川崎医科大学） |
| Degree Affiliation: | 歯学研究科（口腔医学専攻） |
| Type: | theses (doctoral - abstract of entire text) |
| URI: | http://hdl.handle.net/2115/56305 |
| Appears in Collections: | 学位論文 (Theses) > 博士 （歯学）
課程博士 (Doctorate by way of Advanced Course) > 歯学院(Graduate School of Dental Medicine)
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