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Morphogenesis of ellipsoidal camelid red cells : a possible role of a hyperstable membrane skeleton due to a novel alternatively spliced 4.1R
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| Title: | Morphogenesis of ellipsoidal camelid red cells : a possible role of a hyperstable membrane skeleton due to a novel alternatively spliced 4.1R |
| Other Titles: | ラクダ科動物の赤血球が楕円形である仕組み : 特徴的構造をもつ4.1Rによる膜骨格の超安定化作用 |
| Authors: | 陳, 玉琪1 Browse this author |
| Authors(alt): | Chen, Yuqi1 |
| Issue Date: | 23-Mar-2023 |
| Publisher: | Hokkaido University |
| Abstract: | The red blood cells (RBCs) of vertebrates have evolved into two basic shapes, with nucleated nonmammalian RBCs having a biconvex ellipsoidal shape and anuclear mammalian RBCs having a biconcave disk shape. However, the evolutionary molecular mechanism responsible for the difference between ellipsoidal and discoidal shaped RBCs remains unclear. In contrast to other mammalian RBCs, camelid RBCs are flat ellipsoids with reduced membrane deformability, suggesting altered membrane skeletal organization. The characterization of membrane skeletons in camelid RBCs may therefore enable a determination of the mechanisms that underlie the evolutionary divergence of RBC shapes. The present study showed that protein 4.1R, a major component of the membrane skeleton, of alpaca RBCs contains an alternatively spliced exon 14-derived cassette (e14) not observed in the highly conserved 80 kDa 4.1R of other highly deformable biconcave mammalian RBCs. The inclusion of this exon, along with the preceding unordered proline- and glutamic acid-rich peptide (PE), results in a larger and unique 90 kDa camelid 4.1R. Human 4.1R containing e14 and PE, but not PE alone, showed markedly increased ability to form spectrin–actin–4.1R ternary complex in viscosity assays. A similar facilitated ternary complex was formed by human 4.1R possessing a duplication of the spectrin–actin-binding domain, one of the mutations known to cause human hereditary elliptocytosis. The e14- and PE-containing mutant also exhibited an increased binding affinity to β-spectrin compared with wild-type 4.1R. These findings indicate that the presence of 4.1R protein with the e14 cassette results in the formation and maintenance of a hyperstable membrane skeleton, resulting in rigid red ellipsoidal cells in camelid species, and suggest that membrane structure is evolutionarily regulated by alternative splicing of exons in the 4.1R gene. | | 脊椎動物の赤血球の形態は大きくふたつに分類できる。哺乳動物を除く脊椎動物の赤血球は有核、両凸面で楕円状であるのに対して、哺乳動物のほとんどは無核で中窪み円盤状の赤血球をもつ。しかし、ガス交換の促進という共通の役割をもつ赤血球が、進化の過程で、なぜ楕円状、円盤状という異なる形態を獲得したのか、また実際に何がそれぞれの形態を規定するのか、それらの分子機作は不明である。興味深いことに、ラクダ科動物の赤血球は他種哺乳動物と異なり、偏平、小球性の楕円形状で膜変形能は極めて低い。細胞骨格や核・細胞内小器官をもたない哺乳動物赤血球では、その形態と変形能はスペクトリン、アクチン、ならびに4.1Rから構成される膜骨格の構造と物理的性状・機能に依存している。したがって、ラクダ科赤血球の楕円形状の要因として、膜骨格が他種哺乳動物とは異なる構造や物理的性状をもつことが示唆される。一方で、膜骨格を構成するタンパク質の異常は、ヒト・動物の遺伝性楕円赤血球症を引き起こす。本研究では、アルパカ赤血球膜骨格のタンパク質4.1Rに焦点をあて、ラクダ科の赤血球が楕円形状をもつ仕組みの解明を目的に、その構造と機能の解析を行った。
哺乳動物赤血球の4.1Rのアミノ酸配列は種間でよく保存されており、その電気泳動上の分子質量は80 kDaである(4.1R80)。まず、免疫ブロッティングでの解析で、アルパカ赤血球膜の4.1Rを同定し、これが90 kDaの質量を示す(4.1R90)ことを明らかにした。末梢血の網状赤血球からmRNAを調製して4.1RのcDNA配列を解析したところ、スペクトリン–アクチン結合ドメイン(SABD)のN末端側にエクソン14由来の配列(e14)が存在することが示された。エクソン14は可変スプライシングによって組織・時期特異的に発現するもので、他種の赤血球4.1R80のmRNAには存在しない。また、エクソン13由来配列のC末端領域にはプロリンとグルタミン酸を多く含む配列(PE)が存在した。赤血球膜から得た4.1R90のLC-MS/MS解析を行ったところ、e14とPEに相当する配列が検出された。さらに、抗e14抗体を用いた免疫ブロッティングと免疫染色でアルパカ4.1R90が実際にPEとe14配列をもつことを示した。また、末梢血単核球から２段階培養法によって得られた多染性／正染性赤芽球からmRNAを調製してエクソン14の発現を網状赤血球と比較したところ、赤芽球の成熟にしたがってエクソン14を含む転写産物の割合が大きくなることが示された。
4.1Rはスペクトリン、アクチンの両者に結合してスペクトリン–アクチン間結合を安定化させる。ヒト4.1R(h4.1R WT)にPEとe14(PE14)を組み込んだh4.1R[PE14]、あるいはPEを単独で組み込んだh4.1R[PE]を作製し、スペクトリン–アクチン溶液に加え、その粘度の変化によって、これらの組換えh4.1Rがスペクトリン–アクチン–4.1R三者複合体の形成に与える影響を解析した。その結果、h4.1R[PE14]はスペクトリン–アクチン–4.1R三者複合体の形成を著しく促進することが判明した。一方で、h4.1R[PE]には促進作用は認められなかった。また、無症候性のヒト遺伝性楕円赤血球症の原因となるSABDの重複変異体に相当するh4.1R(SABD)2もh4.1R[PE14]と同様に三者複合体形成を顕著に増強する作用を示した。さらに、ꞵ-スペクトリンとの結合において、h4.1R[PE14]はh4.1R WTに比べて平衡解離定数KDで５倍高い結合親和性を示した。
これらの知見から、e14配列をもつ4.1R90が、スペクトリン–アクチン–4.1R間結合の増強を介して、末梢循環血中で受けるシアストレスにより伸展・変形した膜骨格構造を不可逆的に超安定化させることが、ラクダ科赤血球の楕円形状の形成と維持の分子基盤であることが明らかになった。本研究の知見は、赤血球形態の多様性が、進化にともなう4.1R遺伝子の可変スプライシングによって制御され得ることを示唆するものである。 |
| Conffering University: | 北海道大学 |
| Degree Report Number: | 甲第15511号 |
| Degree Level: | 博士 |
| Degree Discipline: | 獣医学 |
| Examination Committee Members: | (主査) 教授 木村 和弘, 教授 稲葉 睦, 教授 滝口 満喜, 准教授 市居 修 |
| Degree Affiliation: | 獣医学院(獣医学専攻) |
| (Relation)haspart: | Chen, Y., Miyazono, K., Otsuka, Y., Kanamori, M., Yamashita, A., Arashiki, N., Matsumoto, T., Takada, K., Sato, K., Mohandas, N., & Inaba, M. (2023). Membrane skeleton hyperstability due to a novel alternatively spliced 4.1R can account for ellipsoidal camelid red cells with decreased deformability. The Journal of biological chemistry, 299(2), 102877. |
| Type: | theses (doctoral) |
| URI: | http://hdl.handle.net/2115/89985 |
| Appears in Collections: | 課程博士 (Doctorate by way of Advanced Course) > 獣医学院(Graduate School of Veterinary Medicine)
学位論文 (Theses) > 博士 （獣医学）
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