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Studies on energy metabolism–related lipid compositions in blood and oocytes at different lactation stages in dairy cows

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Title: Studies on energy metabolism–related lipid compositions in blood and oocytes at different lactation stages in dairy cows
Other Titles: 乳牛の異なる泌乳時期における血液と卵子のエネルギー代謝関連脂質の組成に関する研究
Authors: 古川, 瑛理1 Browse this author
Authors(alt): Furukawa, Eri1
Issue Date: 23-Mar-2023
Publisher: Hokkaido University
Abstract:     As a result of the livestock improvement prioritizing milk production over the last several decades, postpartum dairy cows experience elevation in circulating FFA that can cause multiple health disorders. Normally, excessively incorporated FFA in cells is converted to TAG, a non-toxic form of lipids. However, FFA incorporation beyond the ability of the cells to process can accumulate in cells and induce lipotoxicity. In fact, supplementation of high FFA has been demonstrated to induce lipotoxicity in oocytes in vitro. Investigations on FFA and TAG profiles in oocytes by LC/MS can provide a deeper understanding of lipotoxicity, however, oocyte FFA and TAG of lactating cows have not been studied to date. The objective of the present study was to investigate energy metabolism–related lipid (i.e., FFA and TAG) compositions in plasma and oocytes of cows at different lactation stages, to obtain insights into lipotoxicity in the oocytes of dairy cows, particularly in the early postpartum period. Cows under grazing management with the lower milk production were explored for oocyte FFA and TAG in Chapter Ⅰ, and cows under intensive feeding management with the higher milk production were examined in Chapter Ⅱ. In Chapter Ⅰ, 14 cows (the mean milk yield of 7,710 kg/305 days) at three different lactation stages; the early lactation stage: 25–47 DIM (n = 6), peak lactation stage: 61–65 DIM (n = 4), and middle lactation stage: 160–202 DIM (n = 4), were enrolled. Heifers (n = 4) were used as a control group. Plasma and oocyte samples were collected by caudal venipuncture and OPU, respectively, and analyzed for FFA and TAG compositions by LC/MS. LC/MS lipid analysis detected and annotated a total of 6 FFA and 45 TAG species. Plasma FFA and oocyte TAG showed a positive correlation (r = 0.55, P < 0.05). The early lactation group showed higher oocyte TAG than heifers (P < 0.05), and the peak and middle lactation stage groups showed the intermediate levels of oocyte TAG. However, oocyte FFA was similar between lactation groups. Clustering analysis indicated that FFA and TAG in plasma and oocytes could be categorized into 5 groups; (1) saturated FFA (DB = 0); (2) unsaturated FFA (DB = 1 or 2); (3) 44–48 carbon–TAG (CN ranging between 44 and 48); (4) 50–54 carbon–TAG; and (5) 56–58 carbon–TAG. Regarding compositions of fatty acids, lower proportion of stearic acid (FFA 18:0) and higher proportion of oleic acid (FFA 18:1) in plasma were found in the early and peak lactation groups than in the middle lactation group and heifers (P < 0.05). However, only slight differences were observed in oocyte FFA and TAG fatty acyls between lactation groups. Collectively, early lactation cows under grazing management showed increase in oocyte TAG, but not in oocyte FFA, compared with heifers. This result suggested that the ability to manage lipotoxic FFA in oocytes in early lactation cows was reduced because their storage capacity for TAG was surpassed. Accordingly, oocyte lipid compositions of lactating cows under intensive feeding management, which is the typical management style for the modern high-producing cows, should be investigated, because these cows may experience the larger impact on oocyte lipid compositions during early lactation period due to their larger energy intake and output than in grazed cows. In Chapter Ⅱ, 20 lactating cows (the mean milk yield of 9,123 kg/305 days) under intensive feeding management were used, and they were categorized into four lactation stages; 20–30 DIM (n = 5), 40–50 DIM (n = 5), 60–80 DIM (n = 5), and 130–160 DIM (n = 5). Their plasma and oocyte samples were analyzed for FFA and TAG compositions by LC/MS in the similar methods as Chapter I. Daily energy balance of the cows during 3 weeks prior to OPU was calculated. As expected, plasma FFA was high at 20–30 DIM, decreased by 50 DIM, and was maintained at a low level for the rest of the experimental period. The similar changes were observed in oocyte FFA and TAG with DIM as plasma FFA. Positive correlations were found between the pairs of plasma FFA–oocyte FFA (r = 0.63) and oocyte FFA–oocyte TAG (r = 0.46) (P < 0.05, respectively). Furthermore, oocyte FFA negatively correlated with the mean energy balance 1 and 21 days before OPU (r = -0.70), 1 and 14 days before OPU (r = -0.64), and 1 and 7 days before OPU (r = -0.58) (P < 0.05, respectively), thus the mean energy balance for a longer period before OPU showed a stronger negative correlation with oocyte FFA (r = -0.70, P < 0.05). Oocyte FFA positively correlated with the oocyte FFA desaturase markers, namely, FFA 16:1/16:0 ratio (r = 0.79) and 18:1/18:0 ratio (r = 0.56) (P < 0.05, respectively). Positive correlations were also observed between the plasma and oocyte FFA 16:1/16:0 ratio (r = 0.70) and the plasma and oocyte FFA 18:1/18:0 ratio (r = 0.51) (P < 0.05, respectively). Thus, relationships were noted between the composition and content of FFA in plasma and oocytes. This was the first study that investigated oocyte lipid compositions of cows at different lactation stages and found that the increase in FFA and TAG and accelerated FFA desaturation in oocytes in the early postpartum period of cows under intensive feeding management. These findings suggested that oocytes in early postpartum period are at a risk of FFA lipotoxicity, particularly in cows under intensive feeding management for high milk production. In future studies, the existence and extent of lipotoxicity, such as reactive oxygen species production and endoplasmic reticulum stress, should be explored in oocytes in early postpartum cows, to understand its potential influence on subsequent cow fertility during the lactation.
 過去数十年間の産乳能力を重視した乳牛の遺伝的改良により、乳期当たりの乳量は増加を続けてきた。その結果、高泌乳牛では分娩後の負のエネルギーバランスに伴い血液中の遊離脂肪酸(FFA)濃度が上昇し、この高濃度FFAにより種々の疾病および細胞の機能障害が誘発される。通常、細胞内に流入した過剰なFFAは毒性の無い脂質の貯蔵形態であるトリアシルグリセロール(TAG)に変換される。しかし、細胞の処理能力を超える過剰なFFAが流入すると、FFAは細胞内に蓄積し、細胞毒性を引き起こす。実際に、高濃度のFFAを添加して牛卵子を培養すると、卵子に脂質毒性が発現することが報告されている。液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS)を用いて泌乳牛の卵子のFFAとTAGの組成を調べることは、卵子への脂質毒性の可能性について調査するために有用な方法であるが、これまでに泌乳牛の卵子のFFAとTAGの組成を調べた報告はない。そこで本研究で、特に分娩後早期の牛卵子の脂質毒性について評価するために、泌乳牛の血液と卵子のエネルギー代謝関連脂質(FFAおよびTAG)の組成を調べて泌乳ステージ間で比較した。第1章では産乳量の少ない放牧主体の牛群(平均305日乳量7,710 kg)を、第2章では産乳量の多い濃厚飼料主体で飼養される牛群(平均305日乳量9,123 kg)を用いて、卵子のFFAとTAGを調べた。  第1章では、3つの泌乳ステージにあるホルスタイン種14頭を用いた。泌乳初期群(分娩後25~47日、n = 6)、泌乳ピーク群(分娩後61~65日、n = 4)、泌乳中期群(分娩後160~202日、n = 4)、および未経産牛(n = 4、コントロール群)から血漿および卵子サンプルをそれぞれ尾静脈穿刺と経腟採卵法(OPU)により採取した。サンプル当たり100 μLの血漿および5個の卵子を用いてLC/MSによりFFAとTAGの組成を定性的、半定量的に解析した。その結果、血漿と卵子で合計6種類のFFAおよび45種類のTAGが同定された。血漿FFA濃度と卵子TAG量は正の相関を示した(r = 0.55、P < 0.05)。泌乳初期群は未経産牛よりも卵子TAG量が高く(P < 0.05)、泌乳ピーク群と泌乳中期群はその中間の卵子TAG量を示した。しかし、卵子FFA量はいずれの泌乳期においても同程度であった。クラスター解析により、血漿と卵子のFFAとTAGは5種類のグループ:(1)二重結合数0の飽和FFA、(2)二重結合数1または2の不飽和FFA、(3)炭素数44~48のTAG、(4)炭素数50~54のTAGおよび(5)炭素数56~58のTAGに分類された。脂肪酸の構成割合に関しては、泌乳初期群と泌乳ピーク群では泌乳中期群と未経産牛に比べて、血漿中のステアリン酸(FFA 18:0)の割合が低く、オレイン酸(FFA 18:1)の割合が高かった(P < 0.05)。しかし、卵子FFAと卵子TAGの脂肪酸組成に関しては、泌乳期のステージによる差異は殆どなかった。以上の結果より、放牧主体で飼養される泌乳初期の牛では、未経産牛に比べて卵子TAG量が増加したが、卵子FFA量は増加しなかった。卵子内で貯蔵できるTAG量には限界があることから、泌乳初期の牛の卵子のTAGの増加は、卵子における過剰なFFAをTAGに変換して貯蔵する能力の低下と、それに伴う卵子の脂質毒性のリスク増加を示唆した。  一方で、近年の高泌乳牛の典型的な飼養形態は濃厚飼料主体の飼養であり、放牧牛に比べて摂取エネルギー、消費エネルギーともに大きい代謝状態を示す。このようなエネルギー代謝の違いは卵子の脂質組成に影響する可能性があるため、濃厚飼料主体で飼養される牛の卵子の脂質組成を調べる必要がある。  第2章では、濃厚飼料主体で飼養されていた4つの泌乳ステージにあるホルスタイン種20頭を用いた。分娩後20~30日群(n = 5)、分娩後40~50日群(n = 5)、分娩後60~80日群(n = 5)および分娩後130~160日群(n = 5)から、第1章と同様の方法で、血漿と卵子のサンプルを採取し、LC/MSによりFFAとTAGの組成を解析した。採卵前のエネルギーバランスと卵子の脂質との関係について調べるために、供試牛のOPU前3週間の毎日のエネルギーバランスを計算した。血漿FFA濃度は分娩後20~30日で高く、50日までに低下し、それ以降の供試期間中は低いレベルを維持した。卵子のFFA量とTAG量は、分娩後日数に伴う血漿FFAの変化と同様の変化を示した。血漿FFA濃度と卵子FFA量(r = 0.63)、卵子FFA量と卵子TAG量(r = 0.46)の間にそれぞれ正の相関が見られた(P < 0.05)。さらに、卵子FFA量はOPU前21日間、14日間および7日間の平均エネルギーバランスとそれぞれ負の相関を示し(それぞれr = -0.70、r = -0.64およびr = -0.58、P < 0.05)、その程度はOPU前のエネルギーバランスを調べた期間が長いほど卵子FFA量と強い負の相関を示した(r = -0.70、P < 0.05)。卵子FFA量は、卵子FFA不飽和化マーカー(飽和FFAを単価不飽和FFAに変換する不飽和化反応の活性の指標)であるFFA 16:1/16:0比およびFFA 18:1/18:0比とそれぞれ正の相関を示した(それぞれr = 0.79およびr = 0.56、P < 0.05)。また、血漿と卵子のFFA 16:1/16:0比(r = 0.70)および血漿と卵子のFFA 18:1/18:0比(r = 0.51)の間にも、それぞれ正の相関が見られた(P < 0.05)。すなわち、血漿と卵子で同様のFFAの量と組成の関係が示された。  本研究は異なる泌乳ステージの牛の卵子の脂質組成を調べた初の研究であり、その結果、濃厚飼料主体で飼養される牛における分娩後早期の卵子のFFAとTAGの増加およびFFA不飽和化の活性化が示された。これらの知見は、特に濃厚飼料主体で飼養される高泌乳牛において、分娩後早期の卵子にFFAの脂質毒性がある可能性を示唆するものであった。今後、分娩後早期の牛の卵子への脂質毒性がその後の繁殖性に及ぼす影響について調査するために、卵子中の活性酸素種の産生や小胞体ストレス等の脂質毒性の有無および程度について明らかにする必要がある。
Conffering University: 北海道大学
Degree Report Number: 甲第15514号
Degree Level: 博士
Degree Discipline: 獣医学
Examination Committee Members: (主査) 教授 坪田 敏男, 教授 片桐 成二, 准教授 岡松 優子, 准教授 栁川 洋二郎
Degree Affiliation: 獣医学院(獣医学専攻)
(Relation)haspart: Furukawa E, Chen Z, Ueshiba H, Wu Y, Chiba H, Yanagawa Y, Katagiri S, Nagano M, Hui SP. Postpartum cows showed high oocyte triacylglycerols concurrently with high plasma free fatty acids. Theriogenology 2021;176:174-182.
Furukawa E, Chen Z, Kubo T, Wu Y, Ueda K, Chelenga M, Chiba H, Yanagawa Y, Katagiri S, Nagano M, Hui SP. Simultaneous free fatty acid elevations and accelerated desaturation in plasma and oocytes in early postpartum dairy cows under intensive feeding management. Theriogenology 2022;193:20-29.
Type: theses (doctoral)
Appears in Collections:課程博士 (Doctorate by way of Advanced Course) > 獣医学院(Graduate School of Veterinary Medicine)
学位論文 (Theses) > 博士 (獣医学)

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