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Site-directed mutagenesis study of host and viral proteins : single nucleotide variants of human TBK1 and functional sites of ebolavirus VP35
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| Title: | Site-directed mutagenesis study of host and viral proteins : single nucleotide variants of human TBK1 and functional sites of ebolavirus VP35 |
| Other Titles: | 部位特異的変異導入法による宿主およびウイルス蛋白質の研究 : ヒトTBK1の一塩基多型とエボラウイルスVP35の機能的アミノ酸残基 |
| Authors: | 茂木, 和1 Browse this author |
| Authors(alt): | Kasajima, Nodoka1 |
| Authors(alt): | 笠島, 和1 |
| Issue Date: | 23-Mar-2023 |
| Publisher: | Hokkaido University |
| Abstract: | 新興感染症の約60%を占める人獣共通感染症は、地球規模で公衆衛生上の脅威となっている。人獣共通感染症のうち、エボラウイルス（EBOV）病などのウイルス性出血熱は重篤で死亡率の高い疾患である。また、日本でも血小板減少を伴う比較的致死率の高いウイルス性疾患である重症熱性血小板減少症候群（SFTS）が年間60～90例報告されている。EBOV病やSFTSに対して有効な治療法やワクチンは現在のところ限られている。これらのウイルス感染症の病態を決定する分子メカニズムには、宿主およびウイルス蛋白質の相互作用が深く関わっている。その相互作用を変化させる１つのアミノ酸変異でさえも、ウイルスの病原性や感染病態を左右する可能性がある。
第1章では、宿主蛋白質TBK1の多型に着目した。ヒトに病原性を示すダニ媒介性バンダウイルスであるSFTSウイルス（SFTSV）とハートランドウイルス（HRTV）の非構造（NSs）蛋白質は、インターフェロン（IFN）シグナル経路のTANK-binding kinase 1(TBK1)を標的としてIFNの産生を抑制する。SFTSVは様々な動物種に感染することが知られている一方で、ヒト以外の動物種のTBK1がNSs蛋白質の標的となるのか不明であった。そこでまず、NSs蛋白質の存在下で様々な動物種のTBK1のIFN誘導能について比較検討した結果、ヒトを含む他の哺乳類のTBK1によるIFN誘導は、SFTSVのNSs蛋白質によって抑制される一方で、ニワトリTBK1は抑制を受けないことが分かった。これは、ニワトリのTBK1がSFTSVのNSs蛋白質によるIFN阻害活性に対して抵抗性であることを示唆している。次に、ヒトのTBK1のアミノ酸変異をもたらす一塩基多型（nsSNVs）に着目し、公開データベースからヒトTBK1のnsSNVsを複数選択した。個々のnsSNVsと同一のアミノ酸置換を導入した変異体TBK1を作出し、NSs蛋白質存在下におけるIFN誘導能への影響を調べた。その結果、ヒトTBK1で報告されているnsSNVsの中にはSFTSVやHRTVのNSs蛋白質のIFN阻害活性を著しく低下させるものが含まれていること、またnsSNV変異によってIFN阻害活性への影響の程度が異なることが明らかになった。これらの結果は、nsSNVsを含むTBK1の多型がバンダウイルスNSs蛋白質のIFN拮抗作用に影響を与え、ヒトにおけるSFTSVとHRTVの感染病態に影響を与える因子の1つとなる可能性を示唆する。
第２章では、ヒトに対して高い病原性を示すことが知られているEBOVのウイルス構造蛋白質の一つであるポリメラーゼ補因子（VP35）に注目した。VP35は多機能蛋白質であり、エボラウイルス病の病態に重要な役割を果たす抗IFN因子でもある。本研究では、蛋白質の分子表面特性に着目し、コンピュータ計算によるパッチ解析によって、VP35のインターフェロン抑制に重要なドメイン（IID）の表面に3つの疎水性パッチを同定した。そこで、疎水性パッチの特性を消失させる部位特異的変異を導入したVP35を作出し機能を解析したところ、疎水性パッチ変異体ではEBOV核蛋白質（NP）との相互作用が低下し、ウイルスゲノムの転写・複製の効率が有意に低下することが明らかとなった。さらに、それらの変異体はVP35のIFN阻害機能をも低下させた。これらの結果は、VP35 IIDの表面にある疎水性パッチが本蛋白質の機能にとって重要であることを示している。また、本研究によって、パッチ解析が蛋白質機能に重要なアミノ酸残基を同定するための有用なツールであることが示された。
本学位論文では、遺伝子多型データ解析およびパッチ解析等のバイオインフォマティクスと分子生物学的手法による蛋白質機能解析を組み合わせた研究手法によって、SFTSV、HRTVおよびEBOV病の感染病態に関与しうるアミノ酸変異を探索した。TBK1およびVP35の１アミノ酸変異が蛋白質機能に影響を与える詳細なメカニズムの解明にはさらなる解析が必要であるが、本研究によってこれらの蛋白質の基本特性に関する理解が深まった。本手法を他のウイルスや宿主蛋白質に応用することで、治療薬およびワクチン開発戦略に新たな知見をもたらすことが期待される。 |
| Conffering University: | 北海道大学 |
| Degree Report Number: | 甲第15519号 |
| Degree Level: | 博士 |
| Degree Discipline: | 獣医学 |
| Examination Committee Members: | (主査) 教授 澤 洋文, 教授 髙田 礼人, 准教授 五十嵐 学, 准教授 松野 啓太 |
| Degree Affiliation: | 国際感染症学院（感染症学専攻） |
| (Relation)haspart: | Kasajima N, Matsuno K, Miyamoto H, Kajihara M, Igarashi M, Takada A. 2021. Functional Importance of Hydrophobic Patches on the Ebola Virus VP35 IFN-Inhibitory Domain. Viruses 13:2316. |
| Type: | theses (doctoral) |
| URI: | http://hdl.handle.net/2115/89998 |
| Appears in Collections: | 課程博士 (Doctorate by way of Advanced Course) > 国際感染症学院(Graduate School of Infectious Diseases)
学位論文 (Theses) > 博士 （獣医学）
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